Микробная утилизация полиароматических углеводородов

БОЛЬШАЯ ЛЕНИНГРАДСКАЯ БИБЛИОТЕКА - РЕФЕРАТЫ - Микробная утилизация полиароматических углеводородов

Микробная утилизация полиароматических углеводородов

1.Реферат

Работа посвящена актуальной проблеме современной

экологической биотехнологии - микробной утилизации

полиароматических углеводородов (ПАУ). В рамках работы проведены:

поиск и селекция штаммов ПАУ- резистентных грибов, подбор

питательных сред и адаптация к ним отобранных штаммов, исследованы

процессы деструкции смеси ПАУ грибами Trichoderma linorum и

Phanerochaete chrysosporium, а также процесс фотолиза смеси ПАУ.

Предложена модификация среды Ван-Итерсона для выделения и селекции

грибов-деструкторов целлюлозы, резистентных к ПАУ.

2.Содержание

3.Введение..........................................................

...............................................................

3.1.Актуальность

проблемы............................................................

...............................

3.2.Состояние разработки

проблемы............................................................

.................

3.3.Научная новизна

работы..............................................................

..............................

4.Аналитический

обзор...............................................................

.....................................

4.1.Вредные ароматические вещества-аналоги

компонентов

древесины...........................................................

........................................

4.1.1.Химический состав и структура

древесины.........................................................

4.1.1.1.Целлюлоза...................................................

...........................................................

4.1.1.2.Лигнин......................................................

...............................................................

4.1.1.3.Экстрактивные

вещества............................................................

..........................

4.1.2.Карбонизация древесины. Процессы образования

конденсированных ароматических

систем..............................................................

........

4.1.3.Полиароматические соединения каменноугольной

смолы.................................

4.2.Лигнин и ПАУ-разрушающие

микроорганизмы......................................................

.

4.2.1.Воздействие грибов белой

гнили...............................................................

.............

4.2.2.Воздействие грибов мягкой

гнили...............................................................

...........

4.2.3.Действие

бактерий............................................................

.........................................

5.Цели и задачи

исследования........................................................

..................................

6.Патентный

поиск...............................................................

................................................

7.Экспериментальная

часть...............................................................

..................................

7.1.Материалы и

методы..............................................................

........................................

7.1.1.Материалы.....................................................

...............................................................

7.1.1.1.Штаммы

микроорганизмов.....................................................

...............................

7.1.1.2.Питательные

среды...............................................................

..................................

7.1.1.3.Субстраты...................................................

..............................................................

7.1.1.4.Пробы.......................................................

.................................................................

7.1.2.Методы........................................................

.................................................................

7.1.2.1.Выделение культур

микромицетов........................................................

...............

7.1.2.2.Изучение морфологических и физиолого-

биохимических свойств

микромицетов........................................................

....................

7.1.2.3.Отбор штаммов-деструкторов

ПАУ.................................................................

...

7.1.2.4.Твердофазное культивирование

микроорганизмов............................................

7.1.2.5.Фотолитическая обработка

субстратов..........................................................

.....

7.1.2.6.Определение ПАУ в твердой

фазе................................................................

........

7.2.Результаты и

обсуждение..........................................................

...................................

7.2.1.Направленный поиск микромицетов-деструкторов

ПАУ.....................................

7.2.2.Микробная деструкция смеси

ПАУ.................................................................

.........

7.2.3.Применение облучения ( (=257,3 нм ) для предобработки

ПАУ-содержащих

субстратов..........................................................

...................................

7.2.4.Происхождение микроорганизмов-деструкторов

ПАУ........................................

7.2.5.Анализ возможности создания систем по утилизации

твердых ПАУ-содержащих

отходов.............................................................

......................

8.Стандартизация....................................................

................................................................

9.Охрана труда и окружающей

среды...............................................................

..................

9.1.Характеристика опасных и вредных производственных

факторов..........................

9.2.Пожаробезопасность..............................................

........................................................

9.3.Санитария и

гигиена.............................................................

.............................................

9.4.Безопасная работа в

лаборатории.........................................................

.........................

9.5.Меры первой помощи при несчастных случаях в

лаборатории................................

9.6.Охрана окружающей

среды...............................................................

.............................

10.Технико-экономическая оценка результатов

исследования......................................

10.1.Анализ возможности реализации результатов

исследования..................................

10.1.1.Сегментация

рынка...............................................................

......................................

10.1.2.Позиционирование

товара..............................................................

...........................

10.2.Расчет затрат на проведение исследовательской

работы.......................................

10.2.1.Расчет текущих

затрат..............................................................

.................................

10.2.2.Расчет затрат на проведение дополнительных

работ............................................

11.Выводы и

предложения.........................................................

..........................................

12.Список использованной

литературы..........................................................

............

3.Введение

3.1.Актуальность проблемы

Интенсивное развитие химической и обрабатывающей

промышленности привело к интенсивному накоплению в природных

биоценозах значительных количеств токсичных веществ, что, в свою

очередь, обусловило развитие исследований в области охраны

окружающей среды. Ведущее значение в изучении проблемы

экологической безопасности играет биотехнология, так как все

основные реакции детоксикации или частичной химической модификации

токсичного субстрата связаны с метаболической активностью

микроорганизмов.

Вместе с тем, в решении экологических проблем до последнего

времени (5-7 лет назад) доминировало традиционное направление-

мониторинг объектов окружающей среды и определение ПДК

экотоксикантов. Сегодня ведутся работы по использованию штаммов-

деструкторов экотоксикантов в очистных сооружениях /1/, но вопросы

биодеградации токсичных веществ непосредственно в природных

биоценозах (биоремедиации) и создания промышленных технологий,

позволяющих очищать природные ландшафты от техногенных загрязнений

разработаны недостаточно.

Среди веществ-экотоксикантов полиароматические соединения

занимают одно из первых мест по урону, наносимому окружающей среде.

Спектр этих веществ чрезвычайно разнообразен. Их утилизация

сводится в основном к захоронению на специальных полигонах.

Токсичность, канцерогенность и мутагенность этих веществ

общеизвестна /2/.

Все эти вещества имеют в своей структуре бензольное кольцо,

которое содержится в природном полимере лигнине, являющимся, наряду

с целлюлозой, одним из основных компонентов древесины. Показано

/3/, что почвенные микроорганизмы способны разрушать лигнин и

размыкать, входящее в его структуру, бензольное кольцо. Вполне

возможно, что некоторые из этих микроорганизмов, в процессе

селекции могут приобрести способность утилизировать ПАУ качестве

косубстратов или единственных источников углерода и энергии.

В этой связи представляется перспективной селекция

древоразрушающих микроорганизмов в направлении создания штаммов-

деструкторов ароматических экотоксикантов, способных разрушать эти

вещества в природных биоценозах и промышленных очистных

сооружениях.

3.2.Состояние разработки проблемы

В России и СНГ: В России и СНГ (в основном на Украине) активно

ведутся работы по поиску штаммов-деструкторов отходов

коксохимической промышленности /4/. Изучаются молекулярно-

биологические аспекты деструкции ПАУ. Следует отметить, что

большинство работ выполнено с использованием бактерий рода

Pseudomonas. Сведений об использовании грибов в процессах

детоксикации в отечественной литературе очень мало. Процессам

биоремедиации техногенно загрязненных территорий так же не

уделяется должного внимания (из за мягкого экологического

законодательства).

В других странах: Анализ доступной литературы показал, что в

США и Европе (особенно в ФРГ) ведутся многочисленные исследования

по биодеградации полиароматических экотоксикантов непосредственно в

природных биоценозах. /5-7/. Можно выделить следующие подходы к

решению проблемы, в свете которых ведутся разработки:

1.В почву единовременно или через определенные интервалы

вносится суспензия микроорганизмов, которые разлагают вещества-

загрязнители.

2.В почву вносится специальная питательная среда, содержащая

азот, фосфор, микроэлементы и стимуляторы роста микроорганизмов. В

состав смеси входят добавки, способствующие солюбилизации

гидрофобных соединений. При использовании таких сред почвенная

микрофлора разлагает экотоксиканты значительно быстрее.

Исследователи ФРГ активно разработывают это направление /8/.

3.Совместно используются питательные среды и микроорганизмы

и/или производится предобработка субстрата. Американские ученые

показали эффективность предобработки экотоксикантов УФ-светом с

последующей их утилизацией грибом Phanerochaete chrysosporium и

запатентовали данный процесс /9/.

В США и странах Европы исследованы процессы разрушения таких

конденсированных систем как нафталин, антрацен, фенантрен, пирен и

др./10,11/. Исследованы генетические аспекты деградации

ароматических экотоксикантов /12,13/. Однако исследования носят

узко специализированный характер-изучаются процессы деструкции

одного вещества (в случае смеси исследуется лишь суммарное

содержание веществ либо число компонентов, не превышающее 3-5).

Данные по процессам, идущим при биодеградации и фотолизе

многокомпонентных (более 10-ти веществ) смесей полиароматических

углеводородов отсутствуют как в отечественной так и зарубежной

литературе.

Резюмируя вышеперечисленное можно сказать, что сегодня в

России и развитых зарубежных странах ведутся интенсивные

исследования в области биодеградации техногенных загрязнителей

биоценозов, причем основная роль в процессах детоксикации отводится

грибам белой гнили (особенно Phanerochaete chrysosporium) и

бактериям рода Pseudomonas. Сведения об использовании для

деструкции полиароматических веществ грибов не относящихся к

базидиомицетам носят отрывочный характер /14/. Сведений о процессах

происходящих при деструкции многокомпонентных смесей экотоксикантов

(10 и более компонентов) в доступной литературе не оказалось.

3.3.Научная новизна работы

Предложена модифицированная среда Ван-Итерсона для выделения и

селекции ПАУ-резистентных грибных культур; впервые изучен процесс

деструкции смеси ПАУ, состоящей из 16-ти веществ грибами

Trichoderma lignorum и Phanerochaete chrysosporium. Изучен процесс

фотолиза смеси ПАУ состоящей из 16-ти веществ.

4.Аналитический обзор

4.1.ПАУ-производные компонентов древесины

4.1.1.Химический состав и структура древесины

4.1.1.1.Целлюлоза

Основным компонентом древесины является целлюлоза, ее

содержание в древесине различных пород варьируется от 34,2%

(Chlorophora excelsa Benth. et Hock.f.) до 61,6% (Pinus strobus

L.), в среднем на ее долю в растительных тканях приходится 30-50%

сухого вещества. Кроме целлюлозы, древесина содержит ряд других

полисахаридов: гемицеллюлозу, крахмал, пектиновые вещества, а также

различные органические соединения, такие как лигнин, воска, танин,

смолы и т.д. /15/.

Растительные ткани древесины представляют собой сочетание

клеток разнообразной формы, имеющих сложное строение целлюлозной

стенки, состоящей из 3-х слоев /16/. Первичные клеточные стенки

соседних клеток соединены между собой когезивным межклеточным

веществом-срединной пластинкой. В период роста срединная пластинка

на 2/3 состоит из пектиновых веществ, затем происходит ее

лигнификация /17/.

Вторичная клеточная стенка наиболее утолщена и образует

большую часть клеточной стенки. Она состоит главным образом из

целлюлозы и представляет собой множество концентричных слоев

параллельно расположенных вдоль оси микрофибрилл целлюлозы.

Вторичный слой определяет форму клетки и ее механические свойства

/18/. Толщина третичной стенки достигает 70-80 нм. Из-за высокого

содержания лигнина она прочна и химически устойчива /19/.

По современным данным макромолекула целлюлозы-это линейный

полимер (-D глюкопиранозы с (-1,4-гликозидными связями между

мономерами.

Макромолекула целлюлозы представляет собой стереорегулярный

высокоориентированный кристаллический полимер с различной степенью

полимеризации (степень полимеризации равна числу глюкозных

остатков). Степень полимеризации варьируется в зависимости от

происхождения: от 15 до 14000 .Так, для целлюлозных волокон

хлопчатника, степень полимеризации равна 13000...14000, для

древесной целлюлозы-8000 /20/ .Химический состав целлюлозы

соответствует формуле (С6 Н10 О5)n. Элементарным звеном

макромолекулы является ангидроцеллобиоза, являющаяся основным

продуктом расщепления целлюлозы микробными ферментами /21/.

Олигосахариды- продукты ферментативного гидролиза-(ди, три,

тетрамеры D-глюкозы) растворимы в воде. Однако сама целлюлоза не

растворяется в простых растворителях. Ее можно растворить либо в

комплексных растворителях на основе солей металлов (реактив

Швейцера), либо в неводных смесях органических веществ. Можно так

же получить растворы целлюлозы, переведя ее в сложный (нитрат,

ацетат) или простой эфир. Однако получить растворы целлюлозы, где

молекулы были бы полностью разделены очень трудно. Так молекулы

нитрата целлюлозы (степень полимеризации 6000), благодаря

водородным связям, образуют сетку даже при концентрации их в

растворе всего 0,1% /22/. Наличие водородных связей обуславливает

также важные свойства целлюлозы, такие как гигроскопичность,

скорость растворения, реакционную способность.

В строение древесины, в обеспечение ее механической прочности

и взаимодействии с микробными ферментами важную роль играют участки

целлюлозы с высокой степенью упорядоченности фибрилл-такие участки

получили название кристаллические, в отличие от аморфных участков с

беспорядочной ориентацией. Аморфная целлюлоза, в силу менее плотной

,чем у кристаллической целлюлозы, упаковки фибрилл более доступна

для химических воздействий и микробных ферментов.

Надмолекулярная структура целлюлозы представлена

элементарными фибриллами или мицеллами, диаметр которых составляет

10нм. Мицеллы. в свою очередь, объединяются в микрофибриллы

диаметром 25 нм. Последние формируют целлюлозные волокна. Плотно

упакованные фибриллы образуют подобие кристаллической решетки,

обеспечивая прочность растительной клетки, взаимодействие с

аморфным матриксом, содержащим другие полисахариды и органические

вещества.

4.1.1.2.Лигнин

Наряду с целлюлозой, важным компонентом растительной ткани

является лигнин. Лигнин- один из самых устойчивых и широко

распространенных органических полимеров в природе. Он накапливается

в клеточной стенке и в промежутках между целлюлозными волокнами,

что придает древесине дополнительную прочность и устойчивость к

химическим воздействиям.

В состав древесины входит от 17,6% ( Populus tremuloides

Michx. ) до 39,8% ( Lophira alata Bauks. ex Gaertu.f. ) лигнина

/15/. Содержание лигнина в различных тканях растений различно и

варьируется от 5% до 30% /23/.

Лигнин- сложный трехмерный полимер фенольной природы, в

котором оксифенилпропановые мономеры соединены между собой эфирными

и С-С связями /24/. Роль мономеров играют различные

оксифенилпропановые спирты: конифериловый ( в древесине хвойных

деревьев), синановый (в древесине лиственных растений) и n-

кумаровый (в травянистых растениях) /Рис.1./.

[pic][pic] [pic]

Рис.1.

Структуру лигнина, в отличии от целлюлозы, нельзя описать

простой комбинацией одной или нескольких мономерных единиц с одним

типом связи. В связи с этим структура лигнина является предметом

моделирования. Последняя модель, построенная на основе информации

полученной при изучении соснового (Pinus taeda) лигнина, включает

94 единицы (общая молекулярная масса более 17000) / 15 /. В лигнине

можно насчитать двенадцать типов связей, причем более 50% из них

это (-(-4 и (-(-4 связи /24/. В настоящее время общепринята

концепция которая утверждает, что структура лигнина является

результатом случайного сочетания его предшественников. Наряду с

этой концепцией существуют гипотезы упорядоченного строения

лигнина, однако экспериментальные факты свидетельствуют в пользу

представлений о неупорядоченном строении макромолекулы лигнина.

Важной способностью лигнина является его способность

образовывать тесную ассоциацию с полисахаридными частями клеточной

стенки- лигноцеллюлозные или лигноуглеводные комплексы, в

формировании которых главную роль выполняют ковалентные связи.

Считается, что с лигнином химически связаны полиозы, хотя связь с

целлюлозой полностью не исключаентся. Фрагменты полиоз в

лигноуглеводных комплексах представлены остатками ксилана и

маннана. Из древесины лиственных пород выделяли лигнин-ксилановые

комплексы /25,26/, а из древесины хвойных-лигнин-маннановые и

лигнин-ксилановые /27-31/.

На электронных микрофотографиях елового лигнин-полиозного

комплекса видно, что полиозы внедрены в лигнин, а так же сильно

закручены и перевиты вместе с ним. Чаще всего с лигнином связаны

боковые ответвления полиоз- звенья арабинозы, галактозы и 4-О-

метилглюкуроновой кислоты. Показано, что лигноуглеводные комплексы

богаты именно этими сахарами /28,32/.

При воздействии микроорганизмов на древесину лигнин,

ассоциированный с полисахаридами клеточной стенки, является

основным препятствием для действия микробных ферментов на целлюлозу

растительных тканей.

4.1.1.3.Экстрактивные вещества

Экстрактивные вещества играют огромную роль в жизни дерева и

обуславливают многие свойства древесины (цвет, запах,

резистентность к фитопатогенам и т.д.). При нормальных условиях

доля этих веществ составляет в среднем не более 5%, причем у

различных видов их содержание неодинаково, так например в древесине

Pinus abies содержится 2,22%, а в древесине Populus tremula -

4,53%. Искусственно содержание экстрактивных веществ в сосне

различных видов может доводиться до 15%. При обработке дерева перед

рубкой гербицидом паракваном или подобными соединениями в стволе

появляются зоны, пропитанные смолой (стволовой осмол)/15/.

Химический состав экстрактивных веществ чрезвычайно

разнообразен, однако в свете данной работы нас интересуют лишь их

ароматическая фракция.

Ароматические терпены. Содержание ароматических терпенов в

древесине хвойных пород ничтожно и единственным примером соединений

такого рода является представитель класса монотерпенов (-цимол

(рис.2.).

Рис.2.

Лиственные породы богаче ароматическими терпенами: в древесине

видов Ulmus, Celtis и Zelkowa найдены 5 видов ароматических

сесквитерпенов, среди которых наиболее интересны лацинилен А и 7-

гидроксикадаленаль, содержащие нафталиновое ядро (с.рис.2.)

Простые фенолы. Среди простых фенолов, выделенных их

экстрактивных веществ ели (Picea abies), присутствуют ванилин, n-

гидрокси-бензойальдегид, конифериловый альдегид, гваяцилглицерин, n-

этилфенол, кониферил и сирингин, а так же крезол и другие фенолы.

Некоторые простые фенолы были выделены из древесины сосны (виды

Pinus). Из древесины лиственных пород Populus и Salix выделили n-

гидроксибензойную, ванилиновую, сиреневую, феруловую кислоты,

ванилин, сиреневый альдегид.

В экстрактах древесины Quercus alba обнаружили ряд фенолов,

среди которых присувствовали синаповый, конифериловый, сиреневый

альдегиды, ванилин, пропионгваякол и n-гидроксибензальдегид. В

древесине дуба найдены фенол, крезолы, гваякол, n-этилфенол,

эвгенол и другие фенольные соединения.

Лигнаны. Лигнаны-соединения, состоящие из двух

фенилпропановых единиц, соединенных различными способами. Некоторые

из этих соединений аналогичны димерным структурам, присутствующим в

макромолекуле лигнина. Многие лигнаны, найденные в экстрактах

древесины видов Picea, Pinus, Larix и Tusida содержат цикл

тетрагидрофурана, например пинорезинол, лариццирезинол, конидендрин

и лиовил. Существуют так же и нециклические структуры с (-( связями

между структурными единицами (секоизоларицирезинол) и шестичленные

циклы (изоларицирезинол, конидендрин, пликатин). Из древесины Thuja

plicata выделен пликатинафтол-лигнан, содержащий нафталиновое

ядро(рис.3.)/15/.

Рис.3.

4.1.2.Карбонизация древесины. Процессы образования

конденсированных ароматических систем

После гибели дерева древесина либо разлагается

микроорганизмами либо, в некоторых природных условиях превращается

в ископаемую древесину.

Различают два типа процесса образования ископаемой древесины:

силикатизацию (окаменение) и карбонизацию (углификацию). В свете

нашей работы интерес представляют химические процессы, происходящие

при карбонизации древесины. Рассмотрим их более подробно.

Химический анализ образцов старой и ископаемой древесины

указывает на уменьшение содержание полисахаридов и возрастание

количества негидролизуемого остатка по мере увеличения возраста и

степени деградации. У относительно молодых, но сильно

деградированных образцов обнаружили присутствие микроорганизмов.

Из результатов исследований древних образцов дуба, а также

образцов березы, ясеня и сосны видно, что на степень деградации

влияют окружающие условия, особенно на ранних стадиях. Некоторые

старые образцы (возрастом 8500 лет) содержали больше полиоз, чем

молодые (возрастом 900 лет).

По увеличению относительного содержания целлюлозы в образцах

деградированной древесины видно, что превращения начинаются с

полиоз. Быстрее разрушаются легкорастворимые полиозы, в частности

пентозаны, чем труднорастворимые. Массовая доля полиоз, растворимых

в 5%-ным КОН в ядровой древесине современного образца дуба

,составила 22,4%, а в образце возрастом 8500 лет снизилась до

12,4%,тогда как массовая доля полиоз ,растворимых в 24%-ном КОН,

снизилась с 6,1% только до 5,4% /15/.

Деградация полисахаридов начинается на ранних стадиях

процесса, однако некоторая часть полисахаридов может сохраняться

многие миллионы лет. В образце древесины хвойной породы возрастом

100 млн. лет нашли около 2% сахаров. Из образца древесины из

нижнего мелового периода (140 млн. лет назад) выделили 1,1%

холоцеллюлозы, в гидролизате которой основными сахарами были

глюкоза и манноза. В образце ископаемой древесины семейства

Protopinaceae, очевидно, еще сохранились небольшие количества

целлюлозы и полиоз даже после 180 млн. лет, так как гидролизаты

содержали глюкозу, маннозу и ксилозу.

Лигнин способен сохраняться в течении миллионов лет, но в то

же время он может претерпевать изменения даже и за относительно

короткие промежутки времени. В молекулах лигнина образцов древесины

возрастом 900-4400 лет обнаружили окислительные превращения.

Окисление лигнина было замечено также в образцах древесины

возрастом 30 млн. лет. Лигнин может терять 2/3 метоксильных групп.

ИК-спектры образцов древесины указывают на присутствие

конденсированных колец, образовавшихся главным образом из лигнина.

С увеличением возраста превращение лигнина в конденсированные

ароматические системы усиливается. Битуминозный уголь имеет высокое

содержание таких систем. Конденсация ароматических колец служит

причиной увеличения содержания углерода в процессе карбонизации. В

конце этого процесса получается графит. Ароматические кольца могут

возникать и из продуктов деградации полисахаридов. Известно, что

пировиноградный альдегид может легко ароматизироваться через хиноны

/33/.

В настоящее время каменный уголь является основным источником

ПАУ для промышленности. Таким образом, ПАУ, выбрасываемые

промышленностью в биосферу, являются производными древесины древних

сосудистых растений.

4.1.3.Полиароматические соединения каменноугольной смолы

Каменноугольная смола (креозот) образуется при коксовании

каменного угля и является основным источником ПАУ для химической

промышленности. Именно креозот является основным источником ПАУ-

экотоксикантов.

В составе каменноугольной смолы нами были обнаружены 16 ПАУ,

а именно: нафталин, аценафтен, аценафтилен, флуорен, фенантрен,

антрацен, флуорантен, пирен, бензантрацен, хризен,

бенз[b]флуорантен, бенз[k]флуорантен, бенз[а]пирен, дибензантрацен,

бензперилен, инденопирен (Рис.4.). Больше всего в креозоте

содержится фенантрена и флуорантена. Суммарно эти вещества

составляют 64% фракции ПАУ. Другие вещества, такие как

бенз[а]пирен, хотя и составляют 0,7% фракции ПАУ являются

сильнейшими канцерогенами.

Химически эти вещества представляют собой многоядерные ПАУ.

Содержание нафталина в смеси очень низко. Основная масса ПАУ- трех-

, четырех- и более ядерных соединения.

Рис.4.ПАУ каменноугольной смолы

4.2.Лигнин и ПАУ-разрушающие микроорганизмы

Как было отмечено выше, естественным резервуаром

микроорганизмов-деструкторов ПАУ являются почва и лесная подстилка.

Фитопатогенные грибы, поражающие древесину, также перспективны в

плане отбора ПАУ-разрушающих штаммов.

Грибы, разрушающие древесину, подразделяются на четыре

группы:

1.Грибы бурой гнили- принадлежат к подотделу базидиомицетов,

разрушают, главным образом, полисахариды древесины.

2.Грибы белой гнили- - принадлежат к подотделу

базидиомицетов, разрушают, главным образом, лигнин, однако способны

разрушать полисахариды.

3.Грибы мягкой гнили- сумчатые и несовершенные грибы,

разрушают полисахариды и лигнин.

4.Грибы синевы- сумчатые и несовершенные грибы, живут,

главным образом, за счет остаточных белков паренхимных клетках.

Ограничено разрушают полисахариды.

5.Бактерии- способны разрушать полисахариды и лигнин, однако,

их морфологические свойства (колониальный рост) не позволяет им

выступать в качестве высоко эффективных деструкторов при

твердофазной ферментации.

Таким образом, наиболее перспективными для отбора ПАУ-

разрушающих штаммов являются грибы белой и мягкой гнили (базидио- и

аскомицеты). Рассмотрим влияние их ферментных систем на природные

ароматические вещества.

4.2.1.Воздействие грибов белой гнили

Грибы белой гнили вырабатывают различные ферменты,

способствующие усвоению лигнина /34/. Некоторые из грибов дают,

преимущественно, лакказу, другие пероксидазу и тирозиназу. Процесс

выработки ферментов различен в зависимости от того используется

фермент внутри или вне гиф.

У всех видов диких грибов обнаружена комбинированная

деструкция всех компонентов древесины. Обнаружен фермент, который

нуждается в целлобиозе (продукте разложения целлюлозы) для

деструкции лигнина при совместном действии с локказой /15/.Этот

фермент был назван целлобиозохиноноксиредуктазой. В дальнейшем было

показано, что для разложения лигнина грибом Phanerohaete

chrisosporium.(синоним Sporotrichum pulverolentum) наличие

целлобиозохиноноксиредуктазы не является необходимым. Наличие же

лакказы абсолютно необходимо. Мутант гриба, не вырабатывающий этой

фенолоксидазы, не способен разрушать лигнин.

Изменение в лигнине под воздействием грибов белой гнили

заключается в увеличение содержания карбонильных и карбоксильных

групп. Отношение О/С увеличивается, а Н/С понижается. Увеличение

содержания кислорода происходит в результате окисления (-углеродных

атомов и окислительной деструкции связей между (- и (-углеродными

атомами пропановой цепи. В опытах с меченным (14С) лигнином

показано, что при действии грибов белой гнили (Coriolus versicolor,

Phanerohaete chrysosporium) конечный продукт метаболизма СО2

образуется главным образом из метоксильных групп и в небольшой

степени из углерода пропановых цепей и ароматических колец. Далее

осуществляется окислительное расщепление (-О-4,(-5, (-1 и (-(

связей. При этом получаются мономерные звенья лигнина, которые

далее разрушаются посредством раскрытия ароматического кольца.

Однако, ароматические кольца могут расщепляться и в полимере

лигнина /15/.

4.2.2.Воздействие грибов мягкой гнили

Грибы мягкой гнили вырабатывают ферменты, разрушающие все

компоненты древесины. Деструкция лигнина грибом Chaetomium globosum

до общей потери массы древесины 12% заключается в деметилировании.

С увеличением потери массы происходит дальнейшее разложение

лигнина. Исследования показали, что при этом не происходит

накопление ароматических соединений, следовательно грибы мягкой

гнили разрушают ароматические кольца и в самом лигнине и в

продуктах.

4.2.3.Действие бактерий

Способность различных бактерий разрушать мономеры и

предшественники лигнина показано в опытах с модельными соединениями

/35,36/. Однако, в силу морфологических особенностей бактерии не

способны эффективно разлагать его полимерные формы.

Исследования по разрушению ПАУ почвенными бактериями

показали, что псевдомонады являются наиболее эффективными

деструкторами этих соединений. Исследования показали, что ПАУ

эффективно разлагаются псевдомонадами в условиях глубинной и

твердофазной ферментации, в ризосфере растений /37/.

Исследования механизмов деструкции ПАУ (фенантрена) культурой

Pseudomonas fluorescens показали /4/, что окисление ПАУ бактериями

происходит последовательно, то есть ферментная атака направлена

только на одно кольцо(Рис.5.).

Рис.5.Механизм деструкции фенантрена

Способность разрушать природные ароматические вещества

натолкнула исследователей на мысль об использовании микроорганизмов

для разрушения ароматических и полиароматических веществ- отходов

химической индустрии. В 1990 году американские исследователи

показали, что разрушающие лигнин грибы белой гнили Phanerohaete

chrysosporium способны также разлагать полициклические

ароматические углеводороды до СО2 /38/. Была так же показана

способность бактериальных штаммов разлагать ПАУ /39/. В настоящее

время работы по микробной деструкции ПАУ ведутся, практически, во

всех развитых странах. Показано /40/, что деструкция ПАУ идет

последовательно и начинается с гидроксилирования только одного

ароматического кольца (рис.6.).

Рис.6.Гидроксилирование бензольного кольца. Упрощенная схема

микробной деструкции нафталина

Таким образом простые ПАУ должны разлагаться микроорганизмами

гораздо быстрее чем такие ПАУ как пирен, хризен, 3,4бензпирен и

другие. В соответствии с правилом последовательного окисления

только одного ароматического кольца при деструкции смеси ПАУ должно

происходить накопление полиядерных веществ, разрушение которых

требует длительных сроков инкубации. Правило последовательного

окисления действует для различных видов микроорганизмов.

5.Цели и задачи исследования

Целью работы является изучение процессов биодеградации смеси

вредных ПАУ микроорганизмами, разрушающими древесину и создание на

их основе высокоэффективных штаммов-деструкторов указанных

соединений.

Задачи исследования сводятся к:

1)Поиску в коллекциях и выделению из природных биоценозов

микроорганизмов-деструкторов вредных веществ и отбор наиболее

активных штаммов;

2)Адаптации штаммов к условиям культивирования

(масштабирование процесса);

3)Изучению процессов разрушения многокомпонентной смеси ПАУ в

условиях твердофазной ферментации;

4)Изучению фотолиза ПАУ.

6.Патентный поиск

Поиск патентной информации проводился на базе фундаментальной

библиотеки СПбГТИ(ТУ), объединенной библиотеки ВИЗР и ВНИИСХМ,

библиотеки АН, а также Российской Национальной библиотеки. Поиск

осуществлялся по следующим направлениям: штаммы-деструкторы

ароматических экотоксикантов, питательные смеси для очистки

загрязненных почв, аппаратурное оформление процессов

компостирования твердых отходов, методы предобработки отходов. По

данным направлениям обнаружена следующая инормация:

1.Штамм актиномицетов Streptomyces rochei, осуществляющий

полное разложение 2,4,6-трихлорфенола или 2,4-дихлорфенола или 2,6-

дихлорфенола, или 2-хлорфенола: А.с. 1652335 СССР, МКИ5 С12 N 1/20,

С12 S 13/00/ Головлева Л.А., Заборина О.Е., Перцова Р.Н., Евтушенко

Л.И.; Ин-т биохимии и физиол. микроорганизмов АН СССР.- № 4696431;

Заявл. 08.06.89; Опубл. 30.05.91, Бюл. № 20.

2.Методы и установка для [проведения] аэробного

ферментативного, в частности, для компостирования органических

материалов. Verfahren und Vorrichtung zur aeroben, fermentativen

Hydrolyese, insbesondere zur Kompostierung vor organischen

Stoffen: Заявка 3925905 ФРГ, МКИ5 С12М 1/02, СО5F 9/04/ Hofmann

Hermann, Schnorr Karl Ersnt.-№ 3925905.6; Заявл. 04.08.89; Опубл.

28.02.91.

3.Фотолитически усиленное микробное разрушение [веществ]

загрязняющих окружающую среду. Photochemically enhanced microbial

degradation of enviromental pollutants: Пат. 5342779 США МКИ5 ВО9В

3/00, D06Н 16/00/ Matsumura Fumio, Katayama Arata; The Regents of

the University of California.- №687368; Заявл.18.04.91; Опубл.

30.08.94; НКИ 453/262.5.

4.Улучшенная смесь питательных соединений для биологической

очистки загрязненых почв и вод. Verbesserte Nahrstoffgemische fur

die Bioremediation verschmutzter Boden und Cewasser: Заявка 4228168

ФРГ, МКИ5 С12N 1/26, С12S 9/00/ Kopp-Holtwiesche Bettinna, Weiss

Albricht; Henkel KGaA.-№ 4228168.7; Заявл. 25.08.92; Опубл.

03.03.94.

5.Штамм бактерий - деструктор фенола, бензола и их

галогензамещенных аналогов: Пат. 2041943 Россия, МКИ6 C12N 1/12,

CO2F 3/34/ Зайцев Г.М., Ивойлов В.С; Суровцева Э.Г.; Науч.-произв.

предприятие Биотехинвест. - №92014789/13; Заявл. 28.12.92; Опубл.

20.08.95, Бюл. № 23.

7.Экспериментальная часть

7.1.Материалы и методы

7.1.1.Материалы

7.1.1.1.Штаммы микроорганизмов

В нашей работе были использованы штаммы мицеллиальных грибов

любезно предоставленные Ю.С.Оследкиным (ВНИИСХМ, г.Пушкин).

В таблице №1 приводится список видов и номера штаммов, а

также указывается доступная информация об источнике их

происхождения (организации и/или географическом и/или экологическом

происхождении).

таблица 1

| | | коллекционный/| |

|№п/.п |название штамма | |источник |

| | |музейный | |

| | |номер штамма | |

|1 |Trichoderma linorum | 32 |ARRIAМ |

|2 |Trichoderma linorum | 37 |ARRIAM |

|3 |Trichoderma linorum | 48 |ARRIAM |

|4 |Chaetomium elatum Kunze:Fris | 341 |СПбГУ |

| |1817 | | |

|5 |Chaetomium bainieri Munk 1957 | 344 |СПбГУ |

|6 |Chaetomium funicolum Cooke 1873 | 347 |СПбГУ |

|7 |Chaetomium coclioides Palliser | 491 |Укр.ИСХМ |

| |1910 | | |

|9 |Coriolus versicolor | 330 |ВИЗР |

| |(L.1753:Fr. 1821) Quelet 1888 | | |

| | | |Ленинград- |

|10 |Fusarium solani (Martius) Sacc |464 |ский рег., |

| |1881 | |почва |

| | | |РФ, |

|11 |Fusarium solani (Martius) Sacc |496 |почва |

| |1881 | | |

|12 |Phanerochaete chrysosporium | F-20696|ATCC |

7.1.1.2.Питательные среды

В работе были использованы следующие питательные среды:

1.Среда Ван-Итерсона /41/, г/л:

NH4NO3 -0,5

KH2PO4 -0,5

полоска фильтровальной бумаги -1x12 см

H2O -1 литр

2.Среда Ван-Итерсона модифицированная /42/:

минеральный состав среды тот же, что и в классическом

варианте, полоска фильтровальной бумаги инпрегнированна веществом,

для которого отбирается штамм-деструктор содержание вещества

составляет 5% от массы полоски бумаги

3.Среда Чапека /41/, г:

KH2PO4 -1,0

NaNO3 -3,0

KCl -0,5

MgSO4.7H2O -0,5

FeSO4.7H2O -0,01

H2O -1 литр

4.Среда Чапека с сахарозой/41/:

Минеральный состав без изменений, добалено 30 г/литр

сахарозы

5.Сусло пивное неохмеленное /41/:

Неохмеленное пивное сусло разводится в два раза

водопроводной водой и стерилизуется

Для получения твердых питательных сред добавляли 2 г/литр агар-

агара.

7.1.1.3.Субстраты

Для выделения, отбора, хранения и культивирования

микромицетов использовали следующие субстраты (табл.2.):

таблица 2

|№ |наименование |источник |применение |

|п.п. |субстрата |получения | |

|1 |бумага |Whatman No 1 |выделение |

| |фильтровальная |Великобритания |микромицетов |

|2 |березовые |Столярная |культивирование |

| |опилки |мастерская СПбГТИ(ТУ)|микромицетов |

|3 |древесина |Пропиточный з-д. |культивирование |

| |шпал |г.Отрадное |микромицетов |

7.1.1.4.Пробы

В работе были использованы образцы древесины телеграфных

столбов, подвергшихся воздействию микроорганизмов (Новгородский

регион), любезно предоставленныe Марьяновской Юлией Валентиновной

(кафедра МБТ СПбГТИ(ТУ)).

7.1.2.Методы

7.1.2.1.Выделение культур микромицетов

Выделение первичных культур велось на модифицированной среде

Ван-Итерсона. Для устранения посторонних микроорганизмов образец

короткое время обжигали в пламени спиртовки и помещали на

питательную среду. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности,

гибли, а те микробы, которые находились внутри образца сохраняли

жизнеспособность. Продолжительность инкубации составляла 60 суток.

Остальные условия оговариваются особо.

Выделение чистых культур велось на агаре Чапека с

использованием стандартных микробиологических методов /43/.

7.1.2.2.Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств

культур микромицетов

Для изучения морфологических, культуральных и физиолого-

биохимических свойств культур микромицетов использовали стандартные

микробиологические среды и методы /41/.

Цитоморфологические наблюдения проводили с помощью

общепринятых методов и растворов красителей /41/.

7.1.2.3.Отбор штаммов-деструкторов ПАУ

Отбор целлюлолитических штаммов мицеллиальных грибов

оcуществляли на среде Чапека c целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5%

от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась

визуально.

7.1.2.4.Твердофазное культивирование микроорганизмов

Культивирование мицелиальных грибов в твердой фазе проводили

в кюветах емкостью 0,5 л и бутылях емкостью 30 л.

Содержание среды в кюветах-250 г, в бутылях-2,5 кг.

Перемешивание осуществляли вручную: в кюветах-шпателем, в бутылях

встряхиванием. Периодичность перемешивания и остальные условия

оговариваются особо.

Культивирование мицеллиальных грибов проводилось на

специально разработанных средах, представляющих собой измельченную

древесину, инпрегнированную ароматическими веществами и увлажненную

раствором солей и сахаров. Объем увлажняющей жидкости составлял 200-

400 мл на 1 кг древесины.

Посевной материал для кювет выращивали на чашках Петри на тех

же средах. Чашки Петри засевали суспензией спор, полученной путем

смыва увлажняющей жидкостью с газона 7-суточной культуры на агаре

Чапека. Для засева бутылей использовали содержимое кювет, во всех

случаях посевной материал вносился в количестве 10% от объема

ферментационной среды.

7.1.2.5.Фотолитическая обработка субстратов

Субстраты помещали в кюветы, которые располагались под

источником излучения на расстоянии 50-60 см. Чтобы избежать

перегрева поверхности субстрата, лампа работала периодически, не

более 4 часов в течении рабочего дня.

В качестве источника излучения использовали газоразрядную

лампу ПРК-7 ((max=257,3 нм).

7.1.2.6.Определение ПАУ в твердой фазе

Экспериментальные образцы подвергались сушке в термостате при

105ОС до постоянного веса.

Экстракцию ПАУ осуществляли в аппарате Сокслета в течении 6

часов. В качестве экстрагента использовали предварительно очищенный

от примесей углеводородов гексан.

Полученный экстракт упаривали до небольшого (4-5мл) объема.

Затем в него добавляли около 1г активированного силикагеля

(Silpearl) и упаривали досуха. Далее пробу вносили в разделительную

колонку с силикагелем и вымывали посторонние примеси 40мл гексана.

Затем элюировали фракцию ПАУ 120мл смеси гексан:хлористый метилен

(4:1). Фракцию, содержащую ПАУ упаривали до объема 0,25-1,0мл.

Газхроматографический анализ сконцентрированных компонентов

проводили на хроматографе ’’Цвет-570М’’ с пламенно-ионизационным

детектором на кварцевой капиллярной колонке (30м, 0,25мм) с

неподвижной фазой DB-5 при программном повышении температуры от 70

до 320ОС со скоростью 4ОС в минуту. Количественные данные получали

методом абсолютной градуировки детектора стандартными растворами

ПАУ (’’Экрос’’, Санкт-Петербург). Градуировку по бенз[а]пирену

осуществляли при помощи ГСО 7064-93.

Идентификацию компонентов смеси осуществляли хромато-масс-

спектрометрически на приборе LKB-2091 фирмы LKB-BROMMA (Швеция).

Хроматографические условия были те же, что и в случае

количественного анализа. Идентификацию проводили путем сравнения

масс-спектров электронного удара при помощи компьютерной

информационно-логической системы ’’Компас-МС’’.

7.2.Результаты и обсуждение

7.2.1.Направленный поиск микромицетов-деструкторов ПАУ

Микробная деструкция экотоксикантов в последние десятилетия

стала объектом интенсивных исследований практически во всех

развитых странах мира. Эффективность этого процесса определяется в

первую очередь активностью штамма-деструктора экотоксикантов.

Необходимость интенсифицировать процессы биоремедиации побуждает

исследователей как к проведению селекции коллекционных штаммов, так

и к поиску новых деструкторов /44-46/.

Проведенные эколого-таксономические исследования показали,

что представители микрофлоры лесной подстилки (рода Alternaria,

Cladosporium, Helmintosporium-подобные, Chaetomium и др.), а так же

почвенной микрофлоры ( рода Aspergillus, Trichoderma, Penicillium

и др.) способны разлагать лигниноцеллюлозу и разрушать

ароматические ядра лигнина /34/.

Фитопатогенные грибы так же способны разрушать природные

аромитические вещества (Fusarium) /34/.

Обычно для выделения штаммов, разлагающих то или иное

вещество, используют жидкие или агаризованные среды, содержащие это

вещество как единственный источник углерода и энергии. Однако, по

нашему мнению, для биоремедиации следует использовать

микроорганизмы, сочетающие в геноме способность утилизировать как

экотоксикант, так и целлюлозу, которая содержится в почве и

является основным компонентом твердых отходов. Мы решили, что

наилучшей средой для отбора микромицетов, разрушающих ПАУ в

соокислительных условиях будет среда Чапека с целлюлозой и ПАУ. В

качестве критерия отбора использовали общепринятый метод оценки

роста культур мицеллиальных грибов по характеристике их роста в

баллах через определенные, одинаковые для всех штаммов периоды

времени. Такая методика позволяет отобрать наиболее резистентные и

быстрорастущие штаммы.

Для выделения ПАУ-резистентных целлюлолитиков из природных

биоценозов на наш взгляд наиболее подходит среда модифицированная

Ван-Итерсона /42/, где полоска фильтровальной бумаги была

инпрегнированна ПАУ. На такой среде селективно отбираются ПАУ-

резистентные микроорганизмы. Для отработки методики и с целью

поиска штаммов-деструкторов ПАУ нами из техногенных биоценозов был

выделены ряд микроорганизмов.

Из биоценоза свалки старых телеграфных столбов было отобрано

5 проб древесины, имеющей ярко выраженные биоповреждения. Пробы

помещали в стерильные пробирки с ватно-марлевыми пробками

высушивали и хранили при обычных условиях.

Выделение первичной культуры велось на модифицированной среде

Ван-Итерсона. Для устранения посторонних микроорганизмов образец

короткое время обжигали в пламени спиртовки и помещали на

питательную среду. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности,

гибли, а те микробы, которые находились внутри образца сохраняли

жизнеспособность. Продолжительность инкубации составляла 60 суток,

температура поддерживалась на уровне +25ОС.

Идентификация велась на сусло-агаре и среде Чапека. Было

выделено и идентифицировано 5 штаммов: Trichoderma linorum,

Trichoderma sp. и три представителя рода Fusarium. Хранили штаммы

на модифицированной среде Ван-Итерсона. Во избежании путаницы

штаммам были присвоены музейные номера (см. табл.3. ).

таблица 3

|№ | видовое | музейный номер* |

|п.п. |название | |

| |штамма | |

|1 |Trichoderma linorum | |

| | |Н-1 |

|2 |Trichoderma sp. | |

| | |Н-2 |

|3 |Fusarium sp. | |

| | |Н-3 |

|4 |Fusarium sp. | |

| | |Н-4 |

|5 |Fusarium sp. | |

| | |Н-5 |

*Н- Новгородский рег., 1- порядковый № штамма

Для проведения исследований мы использовали культуры,

выделенные из техногенных биоценозов, а так же коллекционные,

любезно предоставленные Оследкиным Ю.С. (разд. ). Отбор штаммов

оcуществляли на среде Чапека с целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5%

от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась

визуально. Результаты представлены в таблице 4.

таблица 4

| | |коллекцион-|колонизация поверхности |

|№ |название | |субстрата, % |

| | |ный/музейны| |

| | |й | |

|п.п.|штамма | номер | время инкубации, |

| | | |сутки |

| | | штамма |3 |6 |9 |12 |15 |20 |

|1 |Trichoderma lignorum | 32 |0 |0 |2 |4 |2 |2 |

|2 |Trichoderma lignorum | 37 |0 |10 |30 |45 |60 |60 |

|3 |Trichoderma lignorum | 48 |0 |0 |10 |10 |10 |10 |

|4 |Trichoderma linorum | Н-1 |0 |0 |10 |15 |15 |20 |

|5 |Trichoderma sp. | Н-2 |0 |5 |10 |10 |10 |10 |

|6 |Chaetomium elatum | 341 |0 |2 |4 |4 |8 |4 |

|7 |Chaetomium bainieri | 344 |2 |2 |2 |4 |2 |2 |

|8 |Chaetomium funicolum | 347 |0 |4 |4 |6 |4 |2 |

|9 |Chaetomium coclioides | 491 |0 |0 |4 |6 |6 |2 |

|10 |Coriolus versicolor | 330 |0 |0 |6 |8 |2 |2 |

|11 |Fusarium solani | 464 |0 |0 |4 |6 |6 |6 |

|12 |Fusarium solani | 496 |0 |0 |2 |2 |2 |2 |

|13 |Fusarium sp. | Н-3 |0 |0 |4 |6 |6 |6 |

|14 |Fusarium sp. | Н-4 |0 |2 |6 |8 |8 |8 |

|15 |Fusarium sp. | Н-5 |0 |0 |6 |6 |6 |6 |

Практически все исследуемые микроорганизмы обладали

способностью расти и образовывать колонии на поверхности субстрата.

Однако у большинства культур процент заселения поверхности

субстрата был незначителен (до 10%). По-видимому таким культурам

требуется более длительный срок адаптации или наличие стимуляторов

роста. Наибольшей скоростью роста и высокой степенью колонизации

(до 60% площади субстрата) обладал штамм Trichoderma lignorum №37.

Характер роста данного микроорганизма соответствовал каталожному

описанию и заключался на начальных этапах в образовании небольших

колоний диаметром 1-1,5 мм, постепенно сливающихся в единое целое и

формирующих поверхностный мицелий светло зеленого цвета. Этот штамм

и был отобран для дальнейших исследований.

7.2.2.Микробная деструкция смеси ПАУ

Анализ литературных данных показал, что основная масса работ

по деструкции ПАУ посвящена изучению деструкции одного вещества

или смеси ПАУ/6,11,14/, содержащей не более 5 компонентов. Однако в

реальных условиях спектр ПАУ-экотоксикантов гораздо шире. Данные по

деструкции многокомпонентных смесей ПАУ в доступной литературе

отсутствуют. Между тем изучение процессов деструкции смеси

экотоксикантов имеет очень важное значение для разработки процессов

биоремедиации.

Для изучения деструкции смеси ПАУ нами в качестве модельного

субстрата была выбрана древесина шпал. Использование этого

субстрата значительно упрощало работу так как отпадала

необходимость работать с креозотом непосредственно.

Для приготовления ферментационной среды субстрат измельчали

до фрагментов размером около 5 мм и увлажняли жидкой средой Чапека

с сахарозой (см.разд.7.1.). Посевной материал выращивали в чашках

Петри на такой же среде. Объем ферментационной среды составлял