Изучение вопросов биотехнологии в курсе химии средней школы

БОЛЬШАЯ ЛЕНИНГРАДСКАЯ БИБЛИОТЕКА - РЕФЕРАТЫ - Изучение вопросов биотехнологии в курсе химии средней школы

Изучение вопросов биотехнологии в курсе химии средней школы

104

Изучение вопросов биотехнологии в курсе химии средней школы

Введение

Актуальность исследования: в настоящее время российское химическое образование претерпевает глубокие изменения. Возросла необходимость в новых методических разработках, отражающих современное состояние науки. Особого внимания заслуживает информация, касающаяся интеграционных тенденций между различными отраслями знания. Конкретизировать изложенные положения позволяет целый спектр тем, затрагивающих различные направления биологических наук. Одно из первых мест занимают новые направления биотехнологии, прежде всего генетическая инженерия, которая привела к «биотехнологическому буму», свидетелями которого мы являемся.

Таким образом, для ориентации человека в новой информационной и материально-технической среде обитания, формирования реалистического взгляда на окружающий мир необходима постановка новых задач обучения. Преодоление абстрактности и оторванности учебного материала от жизни, которые влекут к потере познавательного интереса, - приоритетная задача обучения. Наличие познавательного интереса является важным условием формирования высокого качества знаний.

Другой стороной абстрактности при изучении биологии является недооценка её роли в возникновении и решении глобальных продовольственных, сырьевых, экологических проблем настоящего и будущего. Кому как не биотехнологии, вышедшей из недр химии и биологии, заниматься этими проблемами. Сегодня нам ясно, что открытия биохимии глубоко скажутся на судьбе человечества.

Учитывая разопщённость и поверхностность вопросов биотехнологии почти во всех предложенных программах (см. главу 2) целью работы является разработка элективного курса по теме «основы биотехнологии» а также комплекса фрагментов включения данного материала в общепринятые биологические программы.

Объект исследования: место и процесс применения изучаемой темы в структуре биологического образования.

Предметом исследования является разработка методических рекомендаций к изучению темы «основы биотехнологии».

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать методическую литературу, обосновать актуальность темы.

2. Проанализировать литературу, дающую обзор основных вопросов биотехнологии.

3. Подобрать материал к проведению уроков по данной теме и разработать методические рекомендации по его использованию.

4. Подобрать лабораторные работы, которые следует включить в изучение данной темы.

5. Провести педагогический эксперимент.

Поставленные задачи решались с использованием методов, соответствующих объекту и предмету исследования

Теоретические

· Анализ литературы по теме, систематизация теоретического материала

· Теоретико-методический анализ проблемы

Эмпирические

· Общепедагогические: наблюдение и самонаблюдение, беседа

· Химические: лабораторный эксперимент

Также была выдвинута гипотеза: при включении материала биотехнологического уклона в учебный процесс предполагаем повышение познавательного интереса и мотивации к обучению у учащихся.

1. Основы биотехнологии (литературный обзор)

1.1 Основы генетической инженерии

История развития генетической инженерии

Генетическая инженерия - раздел молекулярной генетики, исследующий возможности и способы создания лабораторным путем (in vitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, т.е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введением в живой организм (А.А. Баев). Обычно употребляются два названия данного научного направления - генетическая инженерия и генная инженерия, являющиеся как бы синонимами[7]. Однако их смысловое содержание неодинаково: генетическую инженерию связывают с генетикой, а генная имеет отношение только к генам. Кроме того, генетическая инженерия точнее раскрывает содержание дисциплины - создание генетических программ, основная задача которых - создание in vitro молекул ДНК посредством соединения фрагментов ДНК, которые в естественных условиях чаще не сочетаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинантные ДНК). Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор (смотри ниже), обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чужеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя генетические элементы. Согласно определению национальных институтов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке». Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П. Бергом с сотр.) и была составлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бактериофага ? dvgal с галактозным опероном E. coli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.

Генетическая инженерия имеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвала с самых первых своих шагов. Начало этим событиям положило послание участников Гордоновской конференции (1973) президиуму АН США, в котором говорилось о возможной опасности технологий рекомбинантных ДНК для здоровья человека. Возможные блага генетической инженерии признавались с самого начала, но разногласия по данной проблеме не затихли и сейчас. В таблице 1 перечислены основные этапы становления и развития генетической инженерии.

Таблица 1. Основные этапы развития генетической инженерии

Биотехнология рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК включает набор, как новых методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширяют возможности генетических исследований. К наиболее важным методам биотехнологии рекомбинантных ДНК следует отнести следующие:

1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нуклеазами, что в значительной степени ускоряет выделение различных генов и манипуляции с ними.

2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида.

3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последовательности на основе их способности связывать комплементарные основания.

4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

5. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифицированные версии генов (сайт-спецефический мутагенез и т.д.) и затем внедрять их в клетки или организмы.

Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей осуществляется особыми ферментами - рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужеродную ДНК. Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов (сайт узнавания). Соответствующие последовательности в геноме бактерий замаскированы метилированием остатков с помощью метилаз.

Для успешного решения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать (определять последовательность нуклеотидов) любых очищенных фрагментов ДНК[8]. В середине 70-х г. в этой области произошел решительный перелом, связанный с открытием рестриктаз и усовершенствованием метода гель-электрофореза, когда стало возможным разделять достаточно протяженные фрагменты ДНК, отличающиеся размером всего на один нуклеотид. С помощью рестриктаз ДНК стали разрезать на определенные блоки и определять в них позиции нуклеотидов химическими (А. Максам и У. Гилберт 1976) или энзиматическими (Сангер и Коулсон 1975) методами.

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100?С в сильно щелочной среде (рН 13) [9]. При нагревании до 100?С комплементарные пары оснований разрушаются, и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК («плавлением»). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65?С приводит к их спариванию и восстановлению структуры двойной спирали (гибридизация, ренатурация, или «отжиг»).

Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro.

Для эффективного введения (трансформации) необходимо иметь достаточное число копий нуклеотидных последовательностей.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод амплификации фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которого можно достаточно быстро (в течение нескольких часов) получить миллионы копий определенных нуклеотидных последовательностей (генов) [9]. Метод был предложен в 1985 г. К. Мюллисом (биотехнологическая корпорация «Cetus», США) и получил широкое распространение в 1988 г., когда Р. Сайки с соавт. была опубликована основополагающая работа по теории ПЦР и её оптимизации. Метод ПЦР, названный «изобретением века» и очень скоро, в 1993 г., отмеченный Нобелевской премией, ускорил реализацию программы «Геном человека», а также способствовал внедрению в практику клинической диагностики многих заболеваний высокоэффективных диагностических наборов нового поколения.

В методе ПЦР для амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимеразу), которая в присутствии всех 4 видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и коротких 20-30-членных затравок (праймеров) осуществляет синтез комплементарных последовательностей ДНК. ПЦР имеет циклический, включающих нагревание и охлаждение проб, и цепной характер, так как синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Повторяя циклы амплификации 30-40 раз, за 1,5 - 3 ч получают миллионы копий фрагментов ДНК.

Лигазная цепная реакция проводится по принципу, аналогичному ПЦР, но вместо Taq-полимеразы и dNTP используется термостабильная ДНК-лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к амплифицируемому фрагменту ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу; одновременно они комплементарны и другой паре олигонуклеотидов.

NASBA-метод (Nucleic Acid Sequence - Base Amplification), разработанный в последние годы, является наиболее универсальным методом амплификации как ДНК, так и РНК. Этот метод, в отличие от ПЦР, является изотермальным и осуществляется при 41?С. Основными компонентами NASBA-системы являются РНК-полимераза фага Т7, РНКаза Н (гидролизует РНК в составе гибрида РНК:ДНК, но не атакует свободную ДНК) и обратная транскриптаза вируса птичьего миелобластоза. В систему входят также нуклеозидтрифосфаты и два специфических праймера, один из которых содержит участок, представляющий собой последовательность (промотор), распознаваемую РНК-полимеразой.

Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК - лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК - лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» концам; б) с помощью искусственно достроенных «липких» концов.

Сшивание генов (фрагментов) (рис. 1) ДНК по «липким» концам, т.е. взаимнокомплементарным участкам, длиной из 4-6 пар нуклеотидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лигазой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами:

- - А Т Г Ц А А Т Т Ц А Г Т Ц - - - - - -

Т А Ц Г Т Т А А Г Т Ц А Г - - - - - -

Сшивание ДНК-лигаза

А Т Г Ц А А Т Т - Ц А Г Т Ц

Т А Ц Г - Т Т А А - Г Т Ц А Г

Рис. 1. Сшивание генов

При отсутствии комплементарных «липких» концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем (коннекторный метод получения гибридных молекул ДНК), используя концевую (терминальную) дезоксинуклеотидилтрансферазу из тимуса теленка или поли(А) - полимеразу E.coli.

Также, для стыковки фрагментов применяют так называемые линкеры (рис. 2) (или «переходники») - короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы:

- А Т Г Ц А А Т Т Ц Т Г А Г А Т Ц Ц А Т А Ц Г

Т А Ц Г Т Т А А Г А Ц Т Ц Т А Г Г Т А Т Г Ц

Фрагмент 1 Линкер Фрагмент 2

Рис. 2. Объединение фрагментов линкерами

Линкерные фрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем, часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетические и физиолого-биохимические свойства, полезные для человека. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, её разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в её геном и реплицирваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями:

1. Иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции.

2. Иметь свойства репликона.

3. Содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придают ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора.

Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроенных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д. Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов используют плазмиды. Плазмидами называют стабильно наследуемые бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности). Они представляют собой двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды) и др. Например, плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Количество плазмид в клетке может колебаться от одной до более ста.

Первый плазмидный вектор был получен С. Коэном (1973). Его источником была плазмида E. coli R6-5 c Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур.

Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз (рис. 3).

Рис. 3. Схема использования плазмиды pBR322 для отбора клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды[14].

Возможности плазмид для генетической инженерии не беспредельны, что связано с их небольшими размерами. Когда нужно клонировать крупные фрагменты ДНК, удобнее использовать векторы на основе бактериофага ?. Геном фага ? досконально изучен[9]. В центральной части линейного генома фага содержится область, необязательная для литической инфекции, которую и используют для вставки клонируемой ДНК. ДНК фага ? разрезают с помощью рестриктазы Eco RI, удаляют необязательную центральную область и на её место встраивают нужный фрагмент ДНК, получая, таким образом, конкамер - предшественник для упаковки фаговой ДНК в зрелые фаговые частицы. Фаг ? очень пластичен: без нарушения развития фага из него можно убрать до 25% ДНК или пристроить до 6% лишней ДНК. В этот фаговый вектор можно встраивать до 23 000 н.п.

В тех случаях, когда не хватает возможностей фага, используют ещё более крупные векторы - космиды. В состав космид входят: ген (маркер) резистентности к антибиотикам, репликон плазмиды и фрагмент ДНК фага ? (так называемый cos-участок). Этот фрагмент представляет собой однонитевые комплементарные участки на концах фаговой ДНК, т.е. «липкие концы».

Ещё один вид векторов - фазмиды, искусственные гибриды между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК они в одних условиях могут размножаться как фаги, а в других - как плазмиды.

Векторы на основе нитевидных фагов применяют тогда, когда удобнее работать с одной цепью ДНК. Так, фага М13 и fd содержат кольцевую одноцепопочечную ДНК с полностью изученными последовательностями нуклеотидов.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae представляют собой перспективные модели для экспериментов с рекомбинантными ДНК. Их гаплоидный геном содержит 1,4 х 107 н.п. (в 3 раза больше, чем у E.coli), распределенных по 17 хромосомам. Дрожжи не инфицируются вирусами, но в их клетках выявлена плазмида, используемая в качестве вектора - 2 мкм-плазмидная ДНК. Важной особенностью дрожжевых систем является то обстоятельство, что клонируемые фрагменты ДНК способны к рекомбинации с гомологичными участками дрожжевого генома, что ведет к стабильной сайт-специфической трансформации последнего (независимо от сохранения или утраты вектора).

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (или химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм: бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями(CaCl2), обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком.

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией.

Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение её от общей массы возможно также в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5-10 бактерий на 1 см2 поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника.

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту (иммунологический метод Брума-Джилберта) [4]. Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации (Грюнштейн - Хогнесс) [18]. (рис. 4).

Рис. 4. Метод радиоавтографии в применении к поиску рекомбинантных клонов[14].

Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название «шотган» (от англ. shotgun - дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды E.coli, «раскрытые» (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом.

Другой подход, используемый для получения нужных генов, состоит в конструировании на мРНК-матрице комплементарной по отношению к ней ДНК (кДНК) [11].Теперь специфическую мРНК, кодирующую белок, ген которого надо получить, можно использовать в качестве матрицы для ферментативного синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы). (рис. 5).

После расщепления гибрида ДНК-РНК, используя видоизменённую протеазами ДНК-полимеразу E.coli - фрагмент Клёнова, синтезируют двухцепочечную ДНК.

После расщепления «шпильки» остается синтетическая двуцепочечная кДНК, соответствующая белку, кодируемому интересующим нас геном. Заметим, однако, что если эту синтетическую кДНК получали с эукариотической мРНК, то она не идентична природному гену этого белка, поскольку не содержит ни интронов, т.е. вставочных последовательностей, ни стартовых и терминирующих сигналов, присущих генам большинства эукариотических белков. И для экспрессии такого гена в клетках прокариот необходимо, чтобы он находился под контролем прокариотических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществления экспрессии соответствующая кДНК присоединяется к регуляторным элементам бактерии-промотору, оператору и рибосом-связывающему участку.

На современном этапе также возможен химико-ферментативный синтез полинуклеотидных последовательностей. Синтез гена впервые был осуществлён в 1970 году в лаборатории Х.Г. Кораны.

Рис. 5. Схема подготовки кДНК для клонирования[14].

Клонирование и экспрессия генов в различных организмах

В настоящее время разработаны системы клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляют системы клонирования генов в грамположительных бактериях, многие из которых являются сверхпродуцентами важнейших химических соединений[7]. Значительных успехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками Bacillus subtilis, стрептомиценами и Sacchromyces cerevisiae.

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в E.coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид E.coli и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем выделенные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм.

Инсулин - гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний - сахарному диабету.

Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и поставляется на фармацевтические предприятия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г. кристаллического инсулина необходимо 800-1000 кг исходного сырья. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E.coli (рис. 6).

Рис. 6. Экспрессия гена проинсулина человека в составе гибридного белка с ?-галактозидазой[14]

Был синтезирован и ген соматостатина - гормона гипоталамуса. Соматостатин подавляет выделение инсулина и гормона роста человека. В Национальном медицинском центре «Хоуп» (Калифорния) был осуществлен химико-ферментативный синтез гена длиной в 42 нуклеотида, способного кодировать соматостатин. Синтетический ген соматостатина был встроен в плазмиду pBR322 E.coli вблизи конца гена, кодирующего фермент ?-галактозидазу. Между двумя генами был помещен кодон метионина. После введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку кишечная палочка стала синтезировать гибридный белок. Часть его (соматостатин) затем отщепляли от ?-галактозидазы BrCN. Первый синтез соматостатина генно-инженерным способом был осуществлен в 1977 г. Бойером. Выход гормона составил 10 000 молекул на одну клетку. Из 100 г. биомассы E.coli, выращенной в ферментере объемом 8 л, удалось выделить 5 мг соматостатина, т.е. столько, сколько можно его выделить из 100 кг овечьих мозгов.

Соматотропин (или гормон роста человека ГРЧ) секретируется передней долей гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию - гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Обычно его получают из гипофиза трупов, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости в развитых странах. Препарат из трупного материала представляет собой смесь из нескольких форм. Это приводило к тому, что у 30% больных, получавших препарат, против гормона вырабатывались антитела, сводившие на нет его биологическую активность. Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Биосинтез ГРЧ был осуществлен в 1979 г. Д. Гедделем с сотрудниками. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100 000 молекул гормона на клетку.

Проблема введения генов в клетки млекопитающих очень важна для исследования функционирования генов высших эукариот[7].

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соединенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК--клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК+-клетками. Клетки ТК+ легко отличаются от клеток ТК-, поскольку способны расти на средах с аминоптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов). Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных были использованы гибриды бактериальных плазмид с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках E.coli и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК-клетки.

Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Её осуществляют с помощью специальной пипетки (внутренний диаметр её около 1 мкм), а количество инъецированного раствора ДНК составляет 1-2 пкл. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды pBR322 были инъецированы в ТК-клетки, при этом ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку. Таким образом, были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген глобина кролика, ген тимидинкиназного вируса герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Несмотря на определенные успехи в области интеграции чужеродных генов в эмбриональные клетки животных, до сих пор не удалось встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы, вытеснить ген и заменить его новой нуклеотидной последовательность, подчинить новый ген системе регуляции организма.

Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма: повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, - трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.

Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Подсчитано, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК, - мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных.

Первые трансгенные мыши с ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конечной живой массы. Однако у трансгенных свиней с геном ГР (1989) увеличение роста не наблюдалось.

По данным Л.К. Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7% выше по сравнению с контрольными животными. Однако у трансгенных овец с генами Гр и РФ ГР, несмотря на повышенный уровень ГР, скорость роста не увеличивалась.

Одна из важнейших задач использования трансгенных животных в медицине - получение биологически активных соединений за счет включения в клетки организма генов, вызывающих у них синтез новых белков.

В Эдинбурге в 1992 г. были выведены трансгенные овцы с геном ?-1-антитрипсина человека и ?-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г./л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. В России группой ученых под руководством Л.К. Эрнста получены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200-300 мг химозина - основного компонента для производства сыра. Крупное достижение сделано учёными научного центра, в котором была создана первая клонированная овечка - Долли. Исследователи из института Рослина произвели пять поколений птиц, в яичном белке которых содержатся человеческий интерферон и miR24 антитела для борьбы с меланомой[20].

Генно-инженерные методы, в частности технология рекомбинантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целенаправленного изменения генотипа - трансформации - благодаря введению определенных генов.

Формальным явлением генетической инженерии растений считается получение первого в мире химерного растения - санбина (sunbeen) как результат переноса гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника (sunflower+been) [12].

Получение растений с новыми свойствами из трансформированных клеток (регенерация) возможно благодаря их свойству тотипотентности, т.е. способности развиваться в целое растение.

Перенос генов в растительные клетки, так же как и в клетки животных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуществляются главным образом благодаря специфическим структурам - векторам.

Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая образование опухолей - корончатых галлов (рис. 7).

Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A.tumefaciens[12]. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с большой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плазмида (от англ. tumor inducing - индуцирующие опухоль). Ti-плазмиды - это естественные векторы для генов, обладающие всеми функциями, необходимыми для переноса, стабильного включения и экспрессии генетической информации в растениях. Они имеют широкий круг хозяев.

После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина (М. Монтесю и Д. Шелл [6])

Недостаток этих плазмид состоит в том, что некоторые гены, находящиеся в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений независимо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой культивируются данные клетки. В связи с этим очень трудно регенерировать нормальное растение из клеток, содержащих полную последовательность Т-ДНК. Другой недостаток - большие размеры Ti-плазмиды, из-за которых затруднены какие-либо манипуляции с ней, поэтому вставить ген в плазмиду традиционными способами невозможно.

В настоящее время конструируются производные Ti-плазмиды, в которых оставляют регуляторный участок Т-области, а вместо её структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены с позиции их регенерации безвредны для растений (рис 8).

Существуют и другие бактерии (A.rhizogenes), вызывающие усиленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri-плазмиды (от англ. root inducing - индуцирующий корни). Ri-плазмиды выгодно отличаются от Тi-плазмид тем, что они служат естественными безвредными векторами, так как трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перспективные векторы.

Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Только 1-2% вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содержащим. Именно эти вирусы удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК, а также в качестве векторов. Наиболее изученный представитель группы вирусов с двухцепочечной ДНК - вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном растения семейства крестоцветные. Обычно фитовирусы реплицируются с образованием большого числа копий молекул нуклеиновых кислот - 106 на зараженную клетку.

Поэтому фитовирусы представляют собой очень эффективные средства для получения хорошей экспрессии чужеродного гена. Однако вирусы в качестве векторов обладают и существенными недостатками: имеют небольшую емкость, патогенны и неспособны встраиваться в хромосомы хозяина.

Методы прямого переноса генов в растение возникли благодаря появлению специфического объекта - изолированных протопластов, т.е. клеток, лишенных целлюлозной стенки.

1) Трансформация растительных протопластов осуществляется благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть использован практически любой ДНК-вектор.

2) Культуру протопластов на начальной стадии её роста заражают агробактериями, которые используют в качестве векторов.

3) Микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных клеток - 10-20% независимо от типа вектора. Трансформация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение.

4) Электропорация. Метод основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсов высокого напряжения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране.

5) Упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы - сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами.

6) Метод биологической баллистики[6]. Это один из самых эффективных методов трансформации однодольных растений. Исходный материал для трансформации - суспензионная культура, каллусная ткань или 4-5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных. Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие частички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бомбардировка осуществляется с помощью биолистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют и используют для регенерации растений.

Решение проблемы создания новых форм растений подразумевает в первую очередь повышение качества синтезируемых растением продуктов, которые определяют его питательную и техническую ценность. В основном это касается запасных белков.

Начиная с 1970 г. стали появляться серьезные работы по изучению генов азотфиксации и их переносу в клетки Klebsiella pneumoniae и E.coli. Конструирование плазмид, несущих nif-гены, позволяет передавать способность к фиксации азота организмам, не обладающим этим свойством. Среди бактерий, кроме E.coli, такой перенос осуществлен для бактерий Salmonella typhimurium, Erwinia herbicola и других. Однако подобные манипуляции могут приводить к нежелательным эффектам. Так перенос генов в штамм Erwinia (бактерии, вызывающие гниение растений) может усилить его патогенное действие.

В настоящее время внимание ученых привлекают проблемы введения генов азотфиксации в клетки растений; создания ризоценозов между небобовыми растениями (особенно злаками) и азотфиксирующими организмами. Наиболее интересна первая проблема - введение nif-генов в клетки растений. Однако её решение сопряжено с рядом трудностей. Основная - разрушение нитрогеназы под воздействием кислорода. У азотфиксирующих микроорганизмов существует ряд приспособлений, защищающих бактерии от свободного кислорода. Таким образом, введение только nif-генов в какую-то растительную клетку не решает проблемы. Кроме того, сама клетка, в которую переносят гены азотфиксации, может быть не приспособлена к синтезу и расходованию большого количества энергии, которое требуется для фиксации азота. Следовательно, более перспективно повышение эффективности фиксации азота в уже существующих природных системах за счет воздействия на гены, контролирующие этот процесс, а также увеличение мощности корневой системы бобовых растений и создание новых азотфиксирующих систем с помощью методов клеточной инженерии.

Наибольший урон растениям приносят грибные, бактериальные и вирусные патогенны. В растении существуют защитные механизмы, которые в большей или меньшей степени (в зависимости от устойчивости растений) начинают действовать в ответ на проникновение фитопатогенов в клетку. Во-первых, начинается синтез соединений, вызывающих гибель патогенов. Примером могут служить специфические белки PRP (pathogen related proteins). Из них наиболее изучены ферменты хитиназы и ?-1,3 - глюконазы, которые угнетают рост грибов и некоторых видов бактерий, разрушая их клеточные стенки. Во-вторых, могут создаваться структурные барьеры, препятствующие распространению инфекции. Это достигается благодаря лигнификации клеточных стенок.

Так, гены хитиназы и глюконазы кодируются одиночными генами. Благодаря этому были получены трансгенные растения табака и турнепса, в состав генома которых ввели ген хитиназы. Лабораторные и полевые испытания выявили большую устойчивость трансгенных растений. В растения томатов был введен ген защитных пептидов редьки (дефензинов) rs, отвечающих за устойчивость к фитопатогенным грибам.

Другой подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции, состоит во введении в геном исходных растений гена оболочки вируса. Это приводит к ингибированию размножения вируса и снижению инфицированности. Благодаря такому подходу был получен стойкий антивирусный эффект у растений табака, трансформированных геном оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ).

Создание трансгенных растений, устойчивых к насекомым, с помощью методов генной инженерии стало возможным после того, как было обнаружено, что бактерии Bacillus thurengiensis синтезируют специфический белок - прототоксин, высокотоксичный для насекомых. Попадая в кишечник насекомого, этот белок расщепляется, образуя активную форму токсина. В результате насекомое погибает. Ген, ответственный за экспрессию прототоксина, удалось обнаружить, выделить из генома B. thurengiensis и с помощью бинарного вектора ввести в геном растений табака.

Аналогичным образом растения томата были трансформированы генами другого инсектицидного белка - эндотоксина. В итоге были получены первые трансгенные растения, которые не повреждали насекомые (рис. 9).

Исследователи Колорадского университета (США) выяснили, что повреждению растений при замерзании способствуют бактерии эпифитной (поверхностной) микрофлоры Pseudomonas syringae и Erwinia herbicola, белки которых служат центрами кристаллизации[19]. Если обезвредить бактерии стрептомицином, то растения не замерзают при температуре -8?С. Но стрептомицин дорог и вреден, поэтому выгоднее было изменить генетику данного штамма бактерий, вырезав из генома определенный ген. Растения, инфицированные мутантным штаммом P. syringae, росли при отрицательной температуре. Однако оказалось, что бактерии мутантного штамма более живучи и способны вытеснить природный штамм, который, попадая в верхние слои атмосферы, способствует кристаллизации атмосферной влаги. Вероятно, уничтожение природного штамма могло бы привести к экологической катастрофе.

Нельзя не сказать о «неопределённом» влиянии ГМ - продуктов на животные объекты. Всё же отмечены факты: у крыс, которых в течении девяти месяцев кормили ГМ - картофелем, произошло стойкое нарушение иммунной системы и ЖКТ.

Божьи коровки, которые питались тлями, жившими на ГМ - картофеле, становились бесплодными и т.д. Некоторые авторы связывают данные явления с «горизонтальными» потоками генетической информации[19].

Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакторных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций[2]. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). 14 сентября 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1: 100 000), были пересажены её собственные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма (ex vivo) геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3-5 месяцев. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций.

В 1997 году число допущенных к клиническим испытаниям протоколов составляло уже 175, более 2000 пациентов приняли участие в их реализации.

До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы.

Современный уровень знаний не позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровне половых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей человека в связи с реальной опасностью засорения генофонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесением мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества.

1.2 Биотехнологические процессы в пищевой промышленности

Молочные продукты

В пищевой промышленности для получения молочных продуктов применяют, главным образом, ферментацию[4]. В сквашивании молока обычно принимают участие стрептококки и молочнокислые бактерии; лактоза при этом превращается в молочную кислоту. Путем использования иных реакций, которые сопутствуют главному процессу или идут при последующей обработке, получают и другие продукты переработки молока. Среди них пахта, сметана, йогурт и сыр.

В молоке при ферментации могут протекать шесть основных реакций, и в результате образуются молочная (СН3СН(ОН) СООН), пропионовая (СН3СН2СООН) или лимонная кислота ((НООССН2)2С(ОН) СООН), спирт (С2Н5ОН), масляная кислота (С3Н7СООН) или же происходит колиформное газообразование. Главная из этих реакций - образование молочной кислоты. На ней основаны все способы ферментации (сквашивания) молока. Лактоза молока гидролизуется при этом с образованием галактозы и глюкозы. Обычно галактоза превращается в глюкозу ещё до сквашивания. Имеющиеся в молоке бактерии преобразуют глюкозу в молочную кислоту (путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса). Образование сгустка казеина происходит в изоэлектрической точке этого белка (рН 4,6) под действием молочной кислоты. Этот процесс лежит в основе сыроварения.

При производстве швейцарского сыра ключевую роль играет маслянокислое брожение с образованием углекислого газа.

С6Н12О6=СН3СН2СН2СООН+2СО2+2Н2

Именно это обуславливает своеобразный вкус (букет) этих сыров и образование глазков. Характерный вкус пахты, сметаны и сливочного масла формируется в результате лимоннокислого брожения. Он складывается из составляющих вкусов диацетила (СН3С(О) С(О) СН3), пропионовой и уксусной кислот и близких к ним соединений. Различные процессы ферментации молока проводят сегодня в контролируемых условиях. В течение многих прошедших тысячелетий они осуществлялись при участии бактерий, исходно присутствующих в молоке. В наше время для этого используют разнообразные закваски, позволяющие получать молочные продукты нужного качества и типа. Применяющиеся при этом культуры живых бактерий могут представлять либо один какой-то штамм определенного вида, либо несколько штаммов и / или видов.

Хотя свойства сыров чрезвычайно разнообразны, в процессе выработки всех их есть много общего. Первый этап - это подготовка культуры молочнокислых бактерий и засев ею молока. Затем молоко створаживают, для чего обычно применяют фермент реннин. После отделения водянистой жидкости (сыворотки) полученную творожистую массу подвергают термообработке и прессуют в формах. Далее сгусток солят и ставят на созревание. На следующем этапе сыры отправляют на созревание или выдержку. Созревание происходит в специальных помещениях с контролируемой температурой и длится до четырех лет. Микроорганизмы и ферменты в ходе этого процесса гидролизуют жиры, белки и некоторые другие вещества молодого сыра. В результате их распада образуются вещества, придающие сырам характерный вкус.

Из молочных продуктов проще всего получать масло. В зависимости от сорта производимого масла используют сливки с концентрацией от 30-32 до 30-40%. При их сбивании эмульсия масла в воде превращается в эмульсию воды в масле. При производстве масла для улучшения вкуса и лучшей сохранности используют особые культуры бактерий.

При изготовлении сметаны к сливкам добавляют 0,5-1% закваски, используемой при производстве масла. Далее продукт выдерживают, пока концентрация кислоты не достигнет 0,6%.

Известно, что некоторые люди не переносят лактозу. Для них можно выпускать молоко, обработанное ?-галактозидазой - ферментом, который уменьшает содержание лактозы. Для этой цели нужно разработать недорогой промышленный способ производства такого молока. ?-Галактозидазу получают из дрожжей, плесневых грибов и бактерий.

Хлебопродукты

Для производства хлеба до сих пор применяют в основном дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Обычно их растят в ферментерах периодического действия на мелассе (свекловичной или сахарного тростника). В простейшем случае готовят тесто, смешивая муку, воду, дрожжи и соль. При замесе слои теста перемещаются, создаются условия для образования пузырьков газа и подъема теста. Замешанному тесту дают возможность «подойти», а затем режут на куски нужного веса, формуют и выдерживают во влажной атмосфере. При выдержке и на первой, следующей за ней стадии выпечки образовавшиеся при замесе и формовке «зародыши» газовых пузырьков наполняются углекислым газом. Он выделяется в ходе анаэробного сбраживания глюкозы и мальтозы муки. Поднявшееся тесто выпекают. В ходе этого термического процесса крахмал желатинизируется, дрожжи погибают, и тесто частично обезвоживается. Помимо углекислого газа при анаэробном брожении образуются органические кислоты, спирты и эфиры. Все они заметно влияют на формирование вкуса хлеба.

Кроме хлебопечения, крахмал используют для получения низкомолекулярных углеводов. Гидролиз крахмала в промышленном масштабе осуществляется разными способами: только кислотой, кислотой и ферментами и только ферментами. В середине 60-х годов на смену кислотному и кислотно-ферментативному процессам пришел ферментативный способ переработки крахмала, основанный на последовательном применении ?-амилазы B.subtilis и амилоглюкозидазы A.oryzae или A.niger. Кроме производства глюкозы, наиболее заметным успехом в этой отрасли промышленности был выпуск смесей глюкозы и фруктозы. Этот продукт известен под названием изоглюкозы или кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы. Изоглюкоза может заменять сахарозу в большинстве видов пищи. Изомеризация осуществляется ферментами из различных организмов. Выбор их определяется тем, насколько просто с ними работать, нуждаются ли они в кофакторах и стабильны ли (смотри «Основы инженерной энзимологии»).

Бродильные производства

Получение напитков путем спиртового брожения - одно из древнейших бродильных производств. Первыми из таких напитков были, видимо, вино и пиво. До появления работ Пастера в конце ХIХ в. о сути протекающих при брожении процессов и их механизмах было известно очень мало. Пастер показал, что брожение без доступа воздуха осуществляется живыми клетками дрожжей, при этом сахар превращается в спирт и углекислый газ.

С6Н12О6=2С2Н5ОН+2СО2

Тогда же было показано, что брожение осуществляется под действием каких-то веществ, находящихся внутри дрожжевых клеток. Одно из главных нововведений в области микробиологии брожения было предложено Хансеном. Хансен выделил чистые культуры дрожжей и использовал их в пивоварении; тем самым он стал пионером применения таких культур при производстве пива. Сбраживание осуществляется дрожжами рода Saccharomyces. В одних случаях используется природный сахар (например, содержащийся в винограде, из которого делают вино), в других сахара получают из крахмала (например, при переработке зерновых культур в пивоварении). Наличие свободных сахаров обязательно для спиртового брожения при участии Saccharomyces, так как эти виды дрожжей не могут гидролизовать полисахариды. Образование этилового спирта происходит по схеме Эмбдена - Мейергофа - Парнаса.

Традиционным источником нужных для этого полисахаридов в пивоварении всегда был ячмень. Ячменный солод и другие компоненты измельчают и смешивают с водой при температуре до 67?С. В ходе перемешивания природные ферменты ячменного солода разрушают углеводы зерна. На заключительной стадии раствор, называемый суслом, отделяют от нерастворимых осадков. Добавив хмель, его кипятят в медных котлах. После добавления дрожжей всё помещают в бродильный чан. По истечении определенного времени брожение заканчивается, дрожжи отделяют от пива и выдерживают его некоторое время для созревания.

В производстве вина используют сахар виноградного сока. Почти все вино в мире делают из винограда одного вида, Vitis vinifera. Виноделие в отличие от пивоварения до самого последнего времени было основано на использовании диких местных дрожжей. Единственная обработка, которой подвергали виноград до отжима, - окуривание его сернистым газом, чтобы сок не темнел. Кроме того, сернистый газ подавляет деятельность невинных дрожжей; это позволяет винным дрожжам, которые менее чувствительны к нему, осуществлять брожение без помех. При изготовлении красного вина гребни, косточки и кожица до конца брожения находятся в виноградном сусле (мусте), а белое вино делают из чистого сока. После завершения спиртового брожения молодое вино хранят в особых условиях, чтобы оно не испортилось. Если вино не предполагается подвергать яблочно-молочнокислому дображиванию, его обрабатывают сернистым газом, что подавляет окислительные процессы, вызывающие его потемнение. До этого из вина удаляют дрожжи, чтобы прекратить брожение

Производство перегнанного спирта моложе, чем неперегнанных спиртных напитков, но и его корни теряются в веках. Для получения напитка, содержащего 40% (по объему) спирта, нужна перегонка. Её и сегодня осуществляют в перегонных аппаратах, представляющих собой модификации устройства, предложенного в 1830 г. Коффи и носящего его имя. В спиртовом производстве используются пригодные для этой цели штаммы Saccharomyces.

Уксус - это продукт, содержащий не менее 4% (вес/объем) уксусной кислоты; его получают с помощью двухстадийного процесса. Вначале осуществляют спиртовое брожение, в ходе которого сахар сырья превращается в спирт при участии S. cerevisiae. После завершения этого этапа дрожжам дают осесть и собирают надосадочную жидкость. Содержание спирта доводят до 10-13%. На следующем этапе этиловый спирт превращается в уксусную кислоту (промежуточным продуктом является ацетальдегид). Все процессы получения уксуса идут при участии смешанных культур Acetobacter. Брожение происходит а аэробных условиях с потреблением больших количеств кислорода и выделением тепла.

Производство кормового белка

В соответствии с нормами питания человек должен ежедневно получать с пищей 60-120 г. полноценного белка. Если растения и большинство микроорганизмов способны синтезировать все белковые аминокислоты из углекислоты, воды, аммиака и минеральных солей, то человек и животные не могут синтезировать некоторые аминокислоты (валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан и фенилаланин), которые называют незаменимыми. Эти аминокислоты должны поступать в организм в готовом виде с пищей; их отсутствие вызывает тяжелые заболевания человека и снижение продуктивности сельскохозяйственных животных. Незаменимые аминокислоты наиболее сбалансированы в белках семян сои. Относительно высокую биологическую ценность имеют также белки зерна риса и гороха. В белках зерна пшеницы и ячменя очень мало лизина, метионина и изолейцина, а в белках кукурузы ещё и триптофана.

Особый интерес представляет использование микроорганизмов в качестве источника белка и витаминов при производстве пищевых продуктов. Перспектива и экономическая целесообразность употребления микроорганизмов в технологии производства пищевых продуктов диктуется рядом факторов:

1) возможностью использования самых разнообразных химических соединений, в том числе отходов производства, для культивирования микроорганизмов;

2) высокой интенсивностью синтеза белков;

3) относительно несложной технологией культивирования микроорганизмов;

4) относительно высоким содержанием белка и витаминов;

5) повышенным содержанием незаменимых аминокислот по сравнению с растительными белками;

6) возможностью направленного генетического влияния на химический состав микроорганизмов в целях совершенствования белковой и витаминной ценности продукта (ГМО).

В настоящее время мировой дефицит белка составляет около 15 млн. т. Наиболее перспективен микробиологический синтез, что следует из представленных ниже данных. Если для крупного рогатого скота требуется 5 лет для удвоения белковой массы, для свиней - 4 мес., для цыплят - 1 мес., то для бактерий и дрожжей - 1-6 ч. Мировое производство пищевых белковых продуктов за счет микробного синтеза составляет более 15 тыс. т в год. В качестве источников кормового белка чаще используют различные виды дрожжей и бактерий, микроскопические грибы, одноклеточные водоросли, белковые коагулянты травянистых растений.

Дрожжевые клетки в качестве источника углерода для роста способны использовать неразветвленные углеводороды с числом от 10 до 30 углеродных атомов в молекуле. В основном они представлены жидкими фракциями углеводородов нефти с температурой кипения 200-320?С. В России первый завод по производству кормовых дрожжей из жидких парафинов нефти вступил в действие в 1971 г. Альтернативная цепочка расщепления углеводородов: н-Алканы (С9 - С30) Алифатические спирты

Алифатические кислоты Ацил-КоА Ацетил-КоА

При выращивании дрожжей на н-парафинах нефти в приготовленную из них питательную среду добавляют макро- и микроэлементы, необходимые витамины и аминокислоты[13]. Высушенная дрожжевая масса гранулируется и используется как белково-витаминный концентрат (БВК), содержащий до 50-60% белковых веществ, для кормления сельскохозяйственных животных.

Хорошим субстратом для выращивания кормовых дрожжей является молочная сыворотка - производственный отход при переработке молока. В качестве источников углерода дрожжевые клетки могут использовать и низшие спирты - метанол и этанол, получаемые в биотехнологии из природного газа или растительных отходов. Дрожжевая масса, полученная после культивирования дрожжей на спиртах, содержит больше белков (56-62% от сухой массы) и меньше вредных примесей, чем кормовые дрожжи, выращенные на н-парафинах нефти, такие, как производные бензола, D-аминокислоты, аномальные липиды, токсины и канцерогенные вещества. Вместе с тем белки дрожжей частично не сбалансированы по метионину, в них мало цистеина и селенцистеина.

Наряду с технологией использования дрожжевых белков в качестве кормовой добавки в рационы сельскохозяйственных животных разработаны технологии получения из них пищевых белков. Важный резерв пищевого белка и витаминов - остаточные пивные дрожжи Saccharomyces carlsbergensis. Организм человека усваивает свыше 90% всех питательных веществ, содержащихся в них. Пивные дрожжи могут с успехом применяться при производстве колбас в качестве заменителя казеина. Белки дрожжей применяют также при получении искусственного мяса. Для этого их нагревают с последующим быстрым охлаждением или продавливанием белковой пасты через отверстия малого диаметра.

Известно более 30 видов бактерий, которые могут быть применены в качестве источников полноценного кормового белка. Бактериальные белковые концентраты с содержанием сырого белка 60-80% (от сухой массы) - ценные препараты в кормопроизводстве. Следует отметить, что бактерии значительно быстрее, чем дрожжевые клетки, наращивают биомассу и, кроме того, белки бактерий содержат больше цистеина и метионина, что позволяет отнести их в разряд белков с высокой биологической ценностью. Источником углерода при культивировании бактерий могут служить природный и попутный газы, водород, а также спирты - метанол, этанол, пропанол. К числу бактерий с высокой интенсивностью синтеза белков следует отнести и водородокисляющие бактерии, способные накапливать в клетках до 80% сырого белка. Для их культивирования в составе газовой среды обычно содержится 70-80% водорода, 20-30% кислорода и 3-5% СО2.

Для получения кормового белка используют одноклеточные водоросли Chlorella и Scenedesmus, сине-зеленые водоросли из рода Spirulina, способные синтезировать белки из диоксида углерода, воды и минеральных веществ за счет энергии солнечного света. Водоросли для своего развития нуждаются в определенных режимах освещения и температуры и в больших объемах воды. Обычно их выращивают в естественных условиях южных регионов в бассейнах открытого типа. При выращивании водорослей в культиваторах открытого типа с 1 га водной поверхности можно получать до 70 т сухой биомассы в год, что превышает выход биомассы при возделывании пшеницы, риса, сои, кукурузы. Белки водорослей хорошо сбалансированы по содержанию незаменимых аминокислот, за исключением метионина. В клетках водорослей, кроме того, синтезируется довольно много полиненасыщенных жирных кислот и ?-каротина.

В биомассе многих микроскопических грибов хорошо сбалансированы по аминокислотному составу белки; они включают также витамины и липиды. По своим питательным свойствам белки грибов приближаются к белкам сои и мяса, что позволяет использовать из не только для приготовления кормовых концентратов, но и как добавку в пищу человека. Источником углерода для промышленного выращивания микроскопических грибов служат растительные отходы, содержащие клетчатку, гемицеллюлозы, лигнин, а также торф и навоз. В Великобритании создан пищевой продукт, основным компонентом которого является белок грибного происхождения - микопротеин на дешевом глюкозном сиропе, полученном путем гидролиза пшеничного или кукурузного крахмала.

1.3 Основы инженерной энзимологии

Применение ферментов

Ферменты сохраняют свои уникальные свойства (эффективность, специфичность действия) и вне клеток, поэтому их традиционно широко применяют в практике. Биологические катализаторы нетоксичны, работают в мягких условиях, используют доступное сырье (в том числе и отходы), в связи с чем, их применение в промышленности выгодно с экономической и экологической точек зрения. По объему производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из более чем 2000 известных в настоящее время ферментов в промышленности используется около 30.

Таблица 2. Применение ферментов

Задачи инженерной энзимологии заключаются в развитии прогрессивных методов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации; конструировании катализаторов с нужными свойствами и разработке научных основ их применения. В частности, методами белковой инженерии, сущность которых состоит в изменении первичной структуры природной молекулы фермента посредством химической модификации самого энзима или его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центра и его функцию, модулировать субстратную специфичность и физико-химические свойства фермента. Так, замена остатка глутамина-102 в молекуле лактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную малатдегидрогеназу. Созданы гибридные формы ферментной системы, ценной в иммуноферментном анализе, сочетающие в себе свойства ?-галактозидазы и ?-галактокиназы. Важным этапом развития инженерной энзимологии стала разработка способов получения и использования иммобилизованных ферментов.

Иммобилизованные ферменты

Иммобилизованными ферментами называют ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства[7].

Ещё в 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахараза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую активность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осуществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем. В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно - полное или частичное ограничение движения белковых молекул.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего, такие ферменты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Иммобилизованные ферменты долговечны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов.

По Дж. Порату (1974), идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью, как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционноспособную форму). В зависимости от природы носители делятся на органические и неорганические материалы.

Иммобилизация многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органической природы. Существующие органические полимерные носители можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. Среди природных полимеров выделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических - полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные.

К преимуществу природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недостаткам - биодеградируемость и достаточно высокую стоимость. Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель - губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам. Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин. Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена - желатин.

К синтетическим полимерным носителям относятся полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; полиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтетических полимерных носителей обладают механической прочностью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широких пределах величины пор, введения различных функциональных групп.

В качестве носителей неорганической природы наиболее часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей - легкость регенерации.

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации).

При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нельсон, Э. Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. Процесс адсорбции ферментов достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невысокую прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции.

Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго - гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция. Метод непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты.

Сущность способа иммобилизации ферментов в полупроницаемые структуры заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы. Первый способ предложен Т. Чангом в 1964 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонденсации двух соединений, одно из которых растворено в водной, а другое - в органической фазе. Примером может служить образование на поверхности раздела фаз микрокапсулы, получаемой путем поликонденсации гексаметилендиамина - 1,6 (водная фаза) и галогенангидрида себациновой кислоты (органическая фаза).

nН2N(CH2)6NH2+nClC(O) (CH2)8C(O) Cl = (-NH(CH2)6NHC(O) (CH2)8C(O)-)n+2nHCl

К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента. Ферменты, иммобилизованные путем включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран.

Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем - наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов. В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носителем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступающей во взаимодействие с молекулой фермента.

1) Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксогруппами.

Наиболее распространенным методом образования ковалентной связи между ферментом и полисахаридным носителем или синтетическим диольным соединением является бромциановый метод, который был предложен Р. Аксеном, Дж. Поратом и С. Эрнбаком в 1967 г. При обработке носителя бромцианом возникают реакционноспособные цианаты и имидокарбонаты, которые при взаимодействии с нуклеофильными аминогруппами фермента образуют производные изомочевины и уретанов.

Н-OH+BrCN = H-OCN+H2N-Ф=H-OC(NH) - NH-Ф

2) Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих аминогруппами.

Первичные аминогруппы носителя, связанные с ароматическим кольцом, предварительно превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочетания. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольные группы белков. Н-N2++H2N-Ф = H-N=N-NH-Ф+Н+

3) Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы.

Наиболее часто для соединения аминогрупп белка с ацильными группировками носителя используют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот.

Н-С(О) Cl+H2N-Ф = H-C(O) NH-Ф+НCl

4) Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрильными группами.

Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образованием дисульфидных связей под действием кислорода воздуха.

H-SH+0,5О2+HS-Ф = Н-S-S-Ф+Н2О

Наряду с иммобилизацией ферментов в последнее время все большее внимание уделяется иммобилизации клеток и субклеточных структур. Это объясняется тем, что при использовании иммобилизованных клеток отпадает необходимость выделения и очистки ферментных препаратов, применение кофакторов; создается возможность получения полиферментных систем, осуществляющих многостадийные непрерывно действующие процессы.

Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток

Получение глюкозофруктозных сиропов.

Первая промышленная установка для превращения глюкозы во фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы была запущена лишь в 1973 г. Исходным сырьем для этого процесса служит глюкоза, которую получают при гидролизе кукурузного или картофельного крахмала в присутствии минеральных кислот. Для конструирования промышленного биокатализатора глюкоизомеразу сорбируют на пористых неорганических носителях или ионообменных смолах. Возникающий в результате каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42-45% фруктозы, около 51% глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладости соответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы.

Получение L-аминокислот из их рацемических смесей.

Наряду с микробиологическими способами важное значение имеют химические методы промышленного получения природных аминокислот, в том числе незаменимых. Однако в результате химических реакций, используемых для синтеза аминокислот, содержащих асимметрические атомы углерода, с одинаковой скоростью образуются как D-, так и L-стереоизомеры, т.е. всегда возникает рацемическая смесь. Разделение рацемических смесей на составляющие их оптические изомеры (представляющее труднейшую задачу) явилось первым промышленным процессом с использованием иммобилизованных ферментов. Этот процесс был осуществлен в Японии в 1969 г.с помощью аминоацилазы, иммобилизованной на ДЕАЕ-целлюлозе. В качестве исходных соединений в данном превращении используют N-ацилированные производные D-, L - аминокислот, получаемые с помощью химического синтеза. Аминоацилаза гидролизует лишь N-ацил-L-стереоизомер, отщепляя от него ацильный радикал, в результате чего растворимость образующейся L-аминокислоты резко возрастает и ее легко можно отделить от своего антипода физико-химическими методами. При нагревании оставшаяся N-ацил-D-аминокислота рацемизируется, т.е. превращается в исходную смесь, которая вновь подвергается воздействию фермента.

Аминоацилаза строго специфична к структуре только ацильной части субстрата, поэтому одна и та же установка с иммобилизованным ферментом используется для получения различных аминокислот.

Получение L-аспарагиновой кислоты.

Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсластитель и подкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты из получаемого химическим путем фумарата аммония была запущена в 1973 г. в Японии. В ней использованы иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки кишечной палочки E.coli, содержащие аспартат-аммиак-лиазу.

H4NOOC-CH=CH-COOH = HOOC-CH2-CH(NH2) - COOH

Получение L-аланина.

В настоящее время основной промышленный способ получения L-аланина - ферментативное декарбоксилирование L-аспарагиновой кислоты. Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируется аспартат-?-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonas dacunhae, Alcaligenes faecalis, Achromobacter pestifier), иммобилизованных в полиакриламидном геле.

HOOC-CH2-CH(NH2) - COOH = CH3-CH(NH2) - COOH+CO2

Усовершенствование процесса связано с использованием в качестве сырья фумарата аммония. В данном случае процесс получения L-аланина становится двустадийным и реализуется в двух последовательно расположенных колонках. На первом этапе фумарат аммония превращается в L-аспарагиновую кислоту, которая без выделения из реакционной среды на втором этапе претерпевает ?-декарбоксилирование с образованием аланина.

Получение L-лизина

Процесс получения лизина основан на стереоспецефическом ферментативном гидролизе (конверсии) D-, L-?-амино-?-капрлактама, который сначала получают химическим путём из циклогексена. Рацемат используют в качестве субстрата, который под действием лактамазы превращается в L-лизин, а непрореагировавшая D-форма переводится в смесь антиподов рацемазой. Лактамаза найдена у некоторых дрожжей (Candida laurentil). Рацемаза обнаружена у ряда бактерий (Alkaligenes obae).

Получение триптофана

Химико-ферментативный способ получения триптофана состоит в прямой конденсации индола, аммиака и ПВК. Реакцию катализирует пиридоксальзависимая триптофаназа. Фермент найден у E.coli.

Получение L-яблочной кислоты.

Яблочная кислота - заменитель лимонной в продуктах питания и лекарственных препаратах. Яблочную кислоту получают, используя иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки, содержащие фумаратгидратазу. В присутствии этого фермента происходит присоединение воды по двойной связи в молекуле фумаровой кислоты.

HOOC-CH=CH-COOH+H2O = HOOC-CH(OH) - CH2-COOH

Перспективы технологии иммобилизованных ферментов[4]

Сегодня в промышленности реализовано всего четыре крупномасштабные технологии на основе иммобилизованных ферментов (глюкоизомеразы, аминоацилазы, пенициллазы и лактазы). В обозримом будущем иммобилизованные ферменты могут быть использованы для следующих целей.

1. Холинэстераза может применяться для определения пестицидов. Степень ингибирования этого фермента в присутствии пестицидов оценивают электрохимическими или колориметрическими методами.

2. Иммобилизованная диизопропилфторфосфатаза нервных клеток кальмара может найти применение для обезвреживания фосфорорганических нервных газов.

3. Иммобилизованная гепариназа может применяться для предотвращения тромбообразования в аппаратах искусственного кровообращения.

4. Предложен новый способ применения иммобилизованного гемоглобина. Включённый в полиуретановую матрицу белок образует «гемогубку», способную поглощать кислород прямо из воды с эффективностью 80%. Далее кислород высвобождается из полимера под действием слабого электрического разряда. Предполагается, что такая система может снабжать кислородом водолазов либо работающие под водой двигатели.

5. Возможно, вскоре удастся создать системы из нескольких иммобилизованных ферментов. Так, если заключить в микрокапсулы уреазу, глутаматдегидрогеназу и глюкозодегидрогеназу, то их можно будет использовать для удаления мочевины из крови больных с почечной недостаточностью.

6. Разнообразные иммобилизованные ферменты находят применение в датчиках быстрого анализа.

7. В последнее время большое внимание уделяется использованию различных микробных оксигеназных систем в стереоспецефическом эпоксиокислении олефинов.

1.5 Основы получения метаболитов

Процессами биотрансформации называют реакции превращения исходных органических соединений (предшественников) в целевой продукт с помощью клеток живых организмов или ферментов, выделенных из них.

По отношению к процессу роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся на первичные и вторичные метаболиты. Первичные метаболиты необходимы для роста клеток. К ним относятся структурные единицы биополимеров - аминокислоты, нуклеотиды, моносахариды, а также витамины, коферменты, органические кислоты и другие соединения. Вторичные метаболиты (антибиотики, пигменты, токсины) - низкомолекулярные соединения, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста.

Механизмы интенсификации процессов получения продуктов клеточного метаболизма

В норме обмен веществ в клетке осуществляется по принципам строжайшей экономии, что обеспечивается сложнейшей системой регуляции обмена веществ. Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма, что достигается как путем изменения генетической программы организма, так и посредством нарушения регуляторных систем метаболизма в нем[7].

Для выделения из природных популяций высокопродуктивных штаммов микроорганизмов используют методы селекции, т.е. направленного отбора организмов со скачкообразным изменением геномов. Для возникновения мутаций интересующий ген должен удвоиться 106-108 раз. Более эффективен метод искусственного повреждения генома. Таким методом является индуцированный мутагенез, основанный на использовании мутагенного действия ряда химических соединений, рентгеновских и ультрафиолетовых лучей.

Координация химических превращений, обеспечивающая экономность метаболизма, осуществляется у микроорганизмов тремя основными механизмами: регуляцией активности ферментов, в том числе путем ретроингибирования; регуляцией объема синтеза ферментов (индукция и репрессия биосинтеза ферментов); катаболитной репрессией.

В процессе ретроингибирования (ингибирование по принципу обратной связи) активность фермента, стоящего в начале многоступенчатого превращения субстрата, тормозится конечным метаболитом, что детально разработано при изучении регуляции биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов и новообразования ряда аминокислот.

На обмен веществ, аналогичный конечным метаболитам, оказывают эффект их аналоги. Для отбора объектов продуценты выращивают на селективной среде, содержащей подходящий аналог или антиметаболит, которые не включаются в обмен веществ (в частности, аналоги аминокислот не включаются в состав белков), что ведет к подавлению роста организма. Выжившие мутанты обладают дефектами в механизме регуляции активности фермента по принципу обратной связи и поэтому служат важными объектами в обеспечении сверхсинтеза целевого продукта.

Так, мутации по участкам цистрона, детерминирующим структуру аллостерического центра фермента, могут привести к изменениям в конформации белка, которые делают молекулу энзима нечувствительной к концентрации конечного продукта. Это обеспечивает возможность образования в клетке избыточного количества целевого продукта.

Мутации в гене-регуляторе проводят таким образом, чтобы его продукт - белок-репрессор - утрачивал способность связываться либо с индуктором, либо с оператором. В результате мутаций индуцибельные ферменты становятся конститутивными. Мутантные организмы, у которых изменены нуклеотидные последовательности в зоне гена-оператора, не могут связывать нормальный репрессор и также приобретают способность к конститутивной экспрессии структурных генов. Мутанты с дефектами регуляторной области оперона называются регуляторными. Из-за отсутствия или выключения фермента, катализирующего промежуточную стадию процесса, в среде накапливается не конечный продукт, а промежуточный целевой метаболит. Мутанты с ограниченной способностью к образованию конечных продуктов называются ауксотрофными.

Биотехнология получения первичных метаболитов

Производство аминокислот

Среди соединений, получаемых биотехнологическими методами, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая по последнему параметру лишь антибиотикам. Объем мирового производства аминокислот составляет более 500 тыс. т в год, из которых 300 тыс. т приходится на глутамат натрия, 100 тыс. т на лизин и 140 тыс. т на метионин.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

1) гидролизом природного белоксодержащего сырья;

2) химическим синтезом;

3) микробиологическим синтезом;

4) биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

В ходе кислотного гидролиза белков происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющих их аминокислот. При кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (10-30%).

Существенный недостаток методов химического синтеза аминокислот состоит в получении целевых препаратов в виде рацемической смеси D- и L-стереоизомерных форм. Подавляющее большинство природных аминокислот относится к L-ряду. Исключением в этом отношении является лишь метионин, метаболизм которого нестереоизбирателен, благодаря чему данная аминокислота получается преимущественно путем химического синтеза.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот. Более 60% всех производимых в настоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом, главное преимущество которого в сравнении с методами химического синтеза состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.

Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности у некоторых микроорганизмов выделять в культуральную среду значительные количества какой-либо одной аминокислоты (С. Киносита, 1955). При этом было подмечено, что большинство из нескольких тысяч проанализированных диких штаммов микроорганизмов продуцировали аминокислоты во внешнюю среду, но в очень незначительных количествах. И лишь один из обследованных микроорганизмов - Corynebacterium glutamicum был способен к сверхсинтезу глутамата. Этот штамм использовали при организации первого в мире крупномасштабного производства глутаминовой кислоты микробиологическим способом в Токио (1956). Распространенные объекты селекции продуцентов - микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Microcjccus, Corynebacterium, Arthrobacter.

Производство лизина. В клетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного метаболического пути биосинтеза, общего для трех аминокислот - лизина, метионина и треонина.

Эффекта накопления в среде всего одной целевой аминокислоты добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных аминокислот, возникающих в связи с разветвлением метаболического пути. У типичных продуцентов L-лизина - Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum - фермент аспартаткиназа, открывающий метаболический путь, является аллостерическим белком, чувствительным к ингибированию по принципу обратной связи при совместном действии побочных продуктов L-треонина и L-лизина.

Чтобы добиться образования лизина в больших количествах, получают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтезируется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результате чего блокируется синтез метионина и треонина. Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминирующему конформацию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора - лизина.

Производство триптофана. Подобно лизину триптофан образуется в ходе разветвленного метаболического пути, поэтому для его производства используют ауксотрофных мутантов, у которых блокированы реакции, ведущие к синтезу фенилаланина и тирозина. Однако при выращивании мутантных штаммов в среде с минимальной концентрацией этих аминокислот, не вызывающей регуляторных эффектов, избыточное накопление триптофана в среде не наблюдается, что объясняется особенностью процессов регуляции биосинтеза триптофана у микроорганизмов.

Триптофан оказывает ингибирующее действие на антранилатсинтетазу, поэтому для обхода метаболического контроля синтез фермента индуцируют ступенчатым введением предшественника - антраниловой кислоты:

В связи с этой особенностью промышленное производство триптофана организовано преимущественно по двухступенчатой схеме. На первом этапе химическим способом синтезируют антраниловую кислоту, которую с помощью энзиматической системы мутантных штаммов дрожжей Candida utilis переводят в триптофан.

Кроме триптофана микробиологическим способом с использованием предшественников получают гистидин, изолейцин, метионин, серин и треонин.

Для получения аминокислот - конечных продуктов неразветвленных метаболических путей, например аргинина, ауксотрофные мутанты не используют. В этом случае применяют мутанты с дефектами регуляции биосинтеза аминокислоты, т.е. регуляторные мутанты.

Производство витаминов

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов - продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В2, В12, ?-каротин (провитамин А) и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем.

Получение витамина В2 (рибофлавин). Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавин выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени - 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина - гриб Eremothecium ashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В2. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В2 - розеофлавину.

В 1983 г. во ВНИИ генетики микроорганизмов сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, характеризующийся увеличенной дозой оперонов, которые контролируют синтез рибофлавина. Клонированием генов рибофлавинового оперона в одной из созданных плазмид был получен производственный штамм-продуцент витамина В2, способный синтезировать втрое большее по сравнению с E. ashbyii количество рибофлавина всего за 40 ч ферментации.

Получение витамина В12 (цианокобамид). Первоначально витамин В12 получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. Единственный способ его получения в настоящее время - микробиологический синтез. Обнаружение витамина в качестве побочного продукта при производстве антибиотиков в значительной степени стимулировало поиск организмов-продуцентов витамина и изучение путей его образования. Однако механизмы регуляции биосинтеза витамина В12 до настоящего времени полностью не расшифрованы. Известно, что при высоких концентрациях витамин полностью репрессирует синтез ключевых ферментов своего новообразования.

Продуцентами витамина В12 при его промышленном получении служат актиномицеты, метанобразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли. В 70-х годах ХХ в. интерес ученых привлекли пропионовокислые бактерии, известные ещё с 1906 г. и широко использующиеся при приготовлении препаратов животноводства. Выделено 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В12.

Получение ?-каротина и витамина D2. ?-Каротин можно выделить из ряда растительных объектов - моркови, тыквы, облепихи, люцерны. В начале 60-х годов ХХ в. разработана схема микробиологического синтеза ?-каротина, которая стала основой промышленного способа его получения. Установлено, что многие микроорганизмы - фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи - синтезируют каротин. Характерно, что содержание ?-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг ?-каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora - 3-8 тыс. мкг.

Микробиологическим способом получают и витамин D2 (эргокальциферол), при производстве которого освоено дешевое сырье (углеводороды) и установлен стимулирующий эффект ультрафиолетовых лучей на синтез эргостерина культурой дрожжей.

Производство органических кислот

Получение лимонной кислоты. Лимонную кислоту широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Ею заменяют фосфаты в составе детергентов, так как она полностью метаболизируется живыми организмами. Лимонная кислота образует хелаты с металлами, поэтому её применяют для их очистки. Объем мирового производства цитрата составляет 400 тыс. т/год. Производство лимонной кислоты принадлежит к числу старейших промышленных микробиологических процессов: оно было организовано в 1893 г.

Для промышленного производства лимонной кислоты используют главным образом культуру гриба Aspergillus niger. Метаболическим источником лимонной кислоты в организме служит цикл трикарбоновых кислот. Реакция образования лимонной кислоты, катализируемая цитратсинтазой, открывает цикл Кребса. Цитратсинтаза определяет скорость реакций, составляющих цикл Кребса. Активность фермента зависит от концентрации ЩУК, содержание которой может поддерживаться за счет функционирования конститутивной пируваткарбоксилазы, обеспечивающей переключение в аэробных условиях процессов гликолиза и глиоксилевого цикла. Скорость оборота цикла Кребса определяется поддержанием необходимого уровня окисленных форм коферментов дегидрогеназ, поэтому высокий выход цитрата получается лишь при условии хорошей аэрации. Дефицит фосфата ведет к сверхпродукции цитрата.

Одновременно с лимонной было налажено производство молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий рода Lactobacillus.

С 20-х годов налажено промышленное производство D-глюконовой кислоты из глюкозы при участии A.niger. Глюконат натрия, в виде которого обычно выделяют глюконовую кислоту, используют для извлечения металлов, борьбы со ржавчиной, как моющее средство и в качестве медицинского препарата.

Производства, основанные на ацетон-бутанольном брожении и микробиологическая конверсия этанола в ацетат в настоящее время не рентабельны по экономическим соображениям.

Биотехнология получения вторичных метаболитов

Биосинтез вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит по завершении стадии роста, в идиофазе, благодаря чему их ещё называют идиолитами. Среди вторичных метаболитов ведущее место по объему производства занимают антибиотики.

Получение антибиотиков

Организация крупномасштабного производства антибиотиков сыграла решающую роль в становлении промышленной биотехнологии. К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. Способность нитчатого гриба зеленой плесени Penicillium notatum вызывать гибель микроорганизмов впервые была установлена в 1928 г. английским микробиологом А. Флеммингом. Однако лечебные свойства этой плесени были описаны ещё в 1871 г. русским дерматологом А.Г. Полотебновым. Количество открываемых антибиотиков постоянно растет. В 1940 г. было известно всего 6 антибиотиков, а в настоящее время описано более 12 000 аналогичных соединений, из которых в клинике применяют около 200 препаратов. 97% известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. Изыскание новых антибиотиков обусловлено как потребностями практики, так и накоплением резистентных форм микроорганизмов по отношению ко многим антибиотикам.

Главное направление получения новых антибиотиков состоит в химической трансформации природных молекул для создания полусинтетических антибиотиков. Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Направленный биосинтез антибиотиков осуществляется путем прямой ферментации микроорганизма - продуцента с подходящим предшественником, что индуцирует синтез ферментов вторичного метаболизма в идиофазе. Вводимый предшественник должен лимитировать скорость биосинтеза антибиотика. Например, производство бензилпенициллина в значительной степени стимулируется добавками его метаболического предшественника - фенилуксусной кислоты; пропионовая кислота и пропиловый спирт инициируют биосинтез макролидов через метилмалонилКоА; L-фенилаланин - предшественник фенилаланина - ускоряет образование грамицидина S. Аналогичный эффект вызывает использование ингибиторов метаболизма. Так, при подавлении процесса введения хлора микроорганизм S. aureofaciens образует тетрациклин, а не хлортетрациклин.

Другой способ получения антибиотиков состоит в использовании для их биосинтеза блокированных мутантов, у которых отсутствует (блокировано) определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу антибиотика. Блокированные мутанты не способны образовывать нужный антибиотик. Используя низкую субстратную специфичность ферментов вторичного метаболизма и вводя аналоги предшественников антибиотика, последние переводят в аналоги самого антибиотика в ходе процесса, известного как мутационный биосинтез или мутасинтез. Так, мутанты Nocardia mtditerranei, у которых нарушена способность к ацилированию, образуют аналог предшественника рифамицина В-рифамицин SV.

Особенно успешны разработки в области биосинтеза полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов. Получение новых более эффективных аналогов пенициллина основано на изменении природы его ацильной группировки при сохранении в неизменном виде ядра пенициллина - 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). В промышленности 6-АПК получают путем гидролиза природных пенициллинов с помощью специфического фермента - пенициллинацилазы. Некоторые из ацилаз способны катализировать и обратные реакции - процессы ацилирования аминогруппы 6-АПК с образованием модифицированного пенициллина. Таким путем было получено более 4000 полусинтетических пенициллинов.

Получение промышленно важных стероидов

Способность клеток микроорганизмов к сложнейшим процессам биотрансформации наиболее полно реализовалась при получении промышленно важных стероидов. Биотрансформация стероидов обычно заключается в селективном воздействии на одно из положений стероидного скелета. Первый промышленный процесс (1937 г.) микробной биотрансформации стероидов основывался на технологии направленного гидроксилирования (11-?-гидроксилирование) прогестерона.

Важнейший источник стероидных гормонов (эндостраны и эстраны) - культура клеток растений. Так, культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea) корневого происхождения продуцирует фитостерин диосгенин и его гликозидные производные (сапонины). Дальнейшие успехи в производстве стероидных препаратов связывают с применением иммобилизованных клеток.

1.6 Основы биологической переработки отходов

Специфическое применение биотехнологических методов для решения проблем окружающей среды, таких, как переработка отходов, очистка воды, устранение загрязнений, составляет предмет экологической биотехнологии.

Получение биогаза

Биогаз - это смесь из 65% метана, 30% СО2, 1% сероводорода. Энергия, заключенная в 28м3 биогаза, эквивалентна энергии: 16,8м3 природного газа; 20,8 л нефти. В основе получения биогаза лежит процесс метанового брожения или биометаногенез.

Биометаногенез - сложный микробиологический процесс, в котором органическое вещество разлагается до диоксида углерода и метана в анаэробных условиях[7]. Микробиологическому анаэробному разложению поддаются практически все соединения природного происхождения. В анаэробном процессе биометаногенеза выделяют три последовательные стадии, в которых участвуют свыше 190 различных микроорганизмов. На первой стадии под влиянием экстрацеллюлярных ферментов ферментативному гидролизу подвергаются сложные многоуглеродные соединения - белки, липиды и полисахариды. На второй стадии (ацидогенез) в процессе ферментации участвуют две группы микроорганизмов: ацетогенные и гомоацетатные. Ацетогенные Н2-продуцирующие микроорганизмы ферментируют моносахариды, спирты и органические кислоты с образованием Н2, СО2, низших жирных кислот, в основном ацетата, спиртов и некоторых других низкомолекулярных соединений. Гомоацетатные микроорганизмы усваивают Н2 и СО2, а также некоторые одноуглеродные соединения через стадию образования ацетил-КоА и превращают его в низкомолекулярные кислоты, в основном в ацетат. На заключительной третьей стадии анаэробного разложения отходов образуется метан. Он может синтезироваться через стадию восстановления СО2 молекулярным водородом, а также из метильной группы ацетата.

4Н2 + СО2 = СН4 + 2Н2О

3Н2 + СО = СН4 + Н2О

2Н2О + 4СО = СН4 + 3СО2

4НСООН = СН4 + 3СО2+ 2Н2О

4 СН3ОН = 3СН4 + СО2+ 2Н2О

СН3СООН = СН4 + СО2

90-95% используемого углерода метанобразующие бактерии превращают в метан и лишь 5-10% углерода превращаются в биомассу. Процесс ведется при температуре 30-60?С и рН 6-8. Этот способ получения биогаза широко применяют в Индии, Китае, Японии. В настоящее время для производства биогаза чаще используют вторичные отходы (отходы животноводства и сточные воды городов), чем первичные (отходы зерноводства, полеводства), обладающие сравнительно низкой реакционной способностью и нуждающиеся в предварительной обработке. Основное преимущество биогаза состоит в том, что он является возобновляемым и экологически чистым источником энергии.

Очистка сточных вод

Методы очистки сточных вод [4]:

1. Механические методы. Сущность этих методов состоит в том, что из сточных вод путем отстаивания и фильтрации удаляют механические примеси. Механическая очистка позволяет выделять из бытовых сточных вод до 60-75% нерастворимых примесей, а из промышленных - до 95%.

2. Химический метод. В сточные воды добавляют различные реагенты (AL2(SO4)3), которые вступают в реакцию с загрязнителями и осаждают их в виде нерастворимых осадков. Химическая очистка уменьшает количество нерастворимых примесей до 95%, а растворимых - до 25%.

3. Физико-химические методы используют для удаления тонкодисперсных и растворенных неорганических примесей, а также разрушения органических и плохо окисляемых веществ. В арсенал этих методов входят электролиз, окисление, сорбция, экстракция, ионообменная хроматография, ультразвук, высокое давление и др.

4. Биологический метод основан на использовании закономерностей биохимического и физиологического самоочищения рек и других водоемов. Для очистки сточных вод используют биофильтры, биологические пруды и аэротенки.

В биофильтрах (перколяционные фильтры известны с1890г.) сточные воды пропускают через слой крупнозернистого материала, покрытого тонкой бактериальной пленкой, благодаря которой интенсивно протекают процессы биологического окисления. С 1970 г. на смену клинкеру и гравию, в качестве пористого материала, пришли пластмассы.

Аэротенки - огромные резервуары из железобетона, в которых очистка происходит с помощью активного ила (известен с 1914 г.) из бактерий и микроскопических животных, которые бурно развиваются в этих сооружениях, чему способствуют органические вещества сточных вод и избыток кислорода, поступающего с потоком подаваемого воздуха. Процесс более эффективен, чем фильтрация, но характеризуется высокими эксплуатационными расходами (аэрация).

С 1980 г. и по сей день в технологии очистки сточных вод применяется принцип «псевдоожиженного слоя» - сочетание первых двух систем. Реализуется этот принцип в уловителе Саймона-Хартли (периодическое наращивание биомассы проводят в пустотах пористого полиэфира) и оксигенаторе Дорра - Оливера (подложкой служит песок).

После биоочистки проводят хлорирование жидким хлором или хлорной известью. Для дезинфекции используют также ультразвук, озонирование, электролиз.

Микробное выщелачивание

Методы извлечения меди из пород, содержащих минералы, путем обработки их кислыми растворами используются уже много веков. Однако лишь в 50-е и 60-е годы ХХ века выяснилось, что в получении металлов из минералов решающую роль играют бактерии[4]. В 1947 г. Колмер и Хинкл выделили из шахтных дренажных вод бактерию Tiobacillus ferrooxydans. Этот организм окислял двухвалентное железо и восстанавливал серосодержащие соединения, а также, возможно, и некоторые металлы. Вскоре оказалось, что он участвует в переводе меди из рудных минералов в раствор.

Окислительным процессом, катализируемым бактериями, является окисление железа,

4FeSO2 + O2 + 2H2SO4 = 2Fe2 (SO4)3 + 2H2O, (1)

и окисление серы,

S8 + 12O2 + 8H2O = 8H2SO4. (2)

Ряд минералов непосредственно окисляется некоторыми выщелачивающими организмами. Примерами такого рода могут быть окисление пирита,

2FeS2 + 15O2 + 2H2O = 2Fe2 (SO4)3 + 2H2SO4, (3)

и сфалерита,

ZnS + 2O2 = ZnSO4. (4)

Ион трехвалентного железа служит сильным окисляющим агентом, переводящим в раствор многие минералы, например халькоцит,

Cu2S + 2Fe2 (SO4)3 = 2CuSO4 + 2Fe2SO4 +S?, (5)

и уранинит,

UO2 + Fe2 (SO4)3 = UO2SO4 + 2FeSO4. (6)

Выщелачивание, происходящее при участии иона трехвалентного железа, который образуется в результате жизнедеятельности бактерий, называют «непрямой» экстракцией. В настоящее время бактериальное выщелачивание, известное также как биогидрометаллургия или биоэкстрактивная металлургия, применяется в промышленных масштабах для перевода в растворимую форму меди и урана.

Выщелачивание медных отвалов. Для начала процесса выщелачивания отвал смачивают водой, подкисленной серной кислотой до рН 1,5-3,0. Этот кислый раствор, или «выщелачиватель», просачивается сквозь бедную руду или отвальные материалы. Он содержит кислород и углекислый газ и создает благоприятную среду для размножения ацидофильных гиобацилл, широко распространенных в сульфидных рудах. В некоторых случаях содержание Tiobacillus ferrooxydans превышает 106 клеток на 1 кг породы и на 1 мл выщелачивающего раствора. Этот организм активно окисляет растворимые ионы двухвалентного железа (1) и воздействует на серу - и железосодержащие минералы (2) (3). При окислении медно-сульфидных минералов нередко образуется элементарная сера (5). Эта сера маскирует частицы минералов, ограничивая воздействие на них со стороны трехвалентного железа. T. Ferrooxydans, присутствующая в количестве 103-105 клеток на 1 г породы и на 1 мл выщелачивающего раствора, окисляет некоторые растворимые соединения серы и элементарную серу (2). Разрушение серы этим организмом приводит к удалению маскирующего слоя серы, окружающего некоторые частицы минералов, и усиливает процесс выщелачивания. Из выщелачиваемых отвалов вытекают растворы, содержащие 0,75-2,2 г меди в 1 л. Эти растворы направляют в отстойники; медь из них получают путем осаждения с использованием железа или экстракцией растворителями. «Отработанные» выщелачивающие растворы вновь поступают в отвал.

Выщелачивание урана. Бактериальное выщелачивание урана применяли в восточных районах Канады для извлечения остаточного урана на уже выработанных площадях, а также из отвалов. Для роста бактерий достаточно 3-4 месяцев, за это время T. ferrooxydans окисляет железо до трехвалентного состояния. Затем трехвалентное железо окисляет восстановленный уран до растворимого окисленного состояния в соответствии с реакцией (6). Промывные воды, содержащие уран, собирают и извлекают из них уран с помощью ионного обмена либо экстрагируют растворителями. Бактериальное выщелачивание применялось в Канаде и в качестве первичного средства для получения урана. Рудное тело разрушали взрывом и осуществляли выщелачивание in situ.

Практическое применение бактериального выщелачивания сдерживается по ряду причин. Главное препятствие заключается в том, что процесс еще плохо исследован как на опытных установках, так и в полевых условиях. Процессы бактериального выщелачивания нередко протекают медленнее, чем химические процессы. Для бактерий, окисляющих железо и серу, требуется кислая среда. Поэтому для переработки непригодны руды и отходы, поглощающие кислоты в большом количестве. При подземном выщелачивании с помощью растворов следует принимать во внимание такие факторы, как влияние на активность бактерий повышенного гидростатического давления и гипербарической оксигенации.

Биотехнология многолика и по своим историческим корням, и по своей современной структуре, объединяющей элементы фундаментальных наук и прикладных исследований. Её развитие позволяет существенно повышать эффективность использования природных ресурсов, решать экологические проблемы, создавать новые источники энергии. Очевидно, что новые «скачки» биотехнологии глубоко скажутся на судьбе человечества.

Именно поэтому мы считаем необходимым более подробное изучение данного раздела в школьном курсе химии и предлагаем разработку методических рекомендаций, позволяющих сделать данное изучение наиболее эффективным.

2. Содержание вопросов биотехнологии в школьном курсе химии

2.1 Анализ школьных программ и учебников[15]

Основными идеями современной концепции школьного химического образования являются идеи гуманизации и демократизации образования, согласно которым «следует преодолеть отчуждение науки и производства от человека. В процессе обучения химии необходимо раскрывать связь между химическими знаниями и повседневной жизнью человека… [10]»

Программа В.В. Пасечника для 11 класса в курсе общей биологии содержит тему «основы селекции и биотехнологии». Затрагиваются следующие вопросы: микробиологическое производство пищевых продуктов, витаминов, ферментов и лекарств, проблемы и перспективы биотехнологии, генная инженерия её достижения и перспективы.

В.Б. Захаров в программе, рекомендованной для 10-11 классов с углубленным изучением биологических дисциплин в курсе общей биологии в теме «основы генетики и селекции» также затрагивает биотехнологию и генетическую инженерию.

Необходимо отметить, что если базовый стандарт по химии не предусматривает изучение вопросов биотехнологии, то таковой по биологии содержит наиболее общие её аспекты: достижения генной инженерии и перспективы биотехнологии.

2.2 Межпредметные связи по изучению аспектов биотехнологии в средней школе

По программе Р.Г. Ивановой и Л.А. Цветкова в 10 классе предусмотрено изучение темы «промышленное получение важнейших неорганических веществ» (15 часов), при этом затрагивается вопрос охраны окружающей среды от загрязнения. Считаю уместным затрагивание темы переработки отвалов металлургических предприятий биологическими методами (микробное выщелачивание).

О.С. Габриелян предлагает в 9 классе тему-модуль «химические вещества в сельском хозяйстве» (5 ч.). При рассмотрении проблемы защиты окружающей среды от пестицидов возможно акцентирование внимания учащихся на современных разработках в этой области (ГМ растения, резистентные к пестицидам и вредителям). В модуле «химия и экология» (9 кл. 5 ч.) рассматриваются основные источники загрязнений гидросферы и современные способы очистки сточных вод.

В учебнике О.С. Габриеляна, Ф.Н. Маскаева, С.Ю. Пономарёва, В.Н. Терёнина для 10 класса рассматривается тема «биологическиактивные соединения» затрагивающая применение ферментов в промышленности, а также гормональные препараты, витамины и антибиотики. Т.о. здесь уместно рассмотрение основных биотехнологических приёмов получения данных БАВ.

В 11 классе программой предусматривается рассмотрение темы «химия и общество» (8 ч.). Необходимо отметить наличие в ней следующих вопросов: биотехнология и генная инженерия, а также химия и пища. В учебнике О.С. Габриеляна Г.Г. Лысовой, реализующих данную программу, тема содержит объёмный материал, но методам очистки сточных вод и биохимическим основам пищевой промышленности практически ничего не отводится.

Н.С. Ахметов в 9 классе при изучении «металлургии» затрагивает проблемы безотходного производства и охраны окружающей среды. При этом возможно включение основ биометаллургии. Также автор предлагает рассмотрение темы «химия и охрана окружающей среды», в частности вопросов охраны гидросферы.

В учебнике 10-11 классов в разделе «химия и химическая технология» рассматривается производство этанола из древесины, а также «охрана гидросферы» и «биогеохимические процессы».

Г.И. Шелинский предусматривает тему «роль химии в прогрессивном развитии человеческого общества» в 11 классе.

Программа Н.Е. Кузнецовой, И.П. Титовой, А.Ю. Жегина, Н.Н. Гара предназначена для общеобразовательных учреждений естественнонаучного профиля, поэтому в ней прослеживается экологизация курса химии. Авторы раскрывают роль химии в обеспечении жизни и прогрессивном развитии общества. И в 10 классе предлагаются темы: «вещества живых клеток» - полипептиды в природе (гормоны, антибиотики), а также «особенности процессов биотехнологии» - микробиологический синтез, применение генной инженерии и белковой инженерии, бактериальное выщелачивание, проблемы экологического и гуманитарного характера.

В 11 классе авторы рекомендуют темы «гидросфера», где рассматриваются биологические методы очистки воды и «биосфера», где затрагивается проблема микробиологического белка.

Л.С. Гузей, Р.П. Суровцева и Л.М. Кузнецова в своих программах не затрагивают, в явной форме, вопросы биотехнологии.

2.3 Вывод (оптимизация изучения основных направлений биотехнологии в средней школе)

Проанализировав школьные учебники и программы относительно содержания в них материала по вопросам биотехнологии, можно сделать вывод о том, что далеко не все программы предусматривают рассмотрение последних, а если и рассматривают, то в неполном объёме. Таким образом, помимо разработки единого комплекса уроков (элективного курса) по теме «особенности процессов биотехнологии» мы предлагаем примерный план включения материала с биотехнологическим уклоном в «стандартные» темы школьного курса химии.

Функция включения материала, в форме элективного курса - внутрипрофильная специализация обучения, в форме комплекса фрагментов - расширение знаний учащихся, преодоление оторванности учебного материала от жизни[1].

3. Разработка элективного курса и педагогический эксперимент

3.1 Тематическое планирование элективного курса «Основы биотехнологии»

1. Биотехнология. Биотехнологические процессы в пищевой промышленности.

2. Биотехнологическая переработка отходов.

3. Бактериальное выщелачивание.

4. Основы получения БАВ. Производство кормового белка.

5. Производство аминокислот, витаминов и антибиотиков.

6. Применение ферментов.

7. Практическая работа «Приготовление иммобилизованных ферментных препаратов.

8. Основы генной инженерии.

9. Применение генной инженерии.

10. Итоговая проверочная работа.

3.2 Поурочное планирование элективного курса

УРОК №1 по теме «Биотехнология. Биотехнологические процессы в пищевой промышленности»

Задачи:

1. Образовательная: знакомство с биотехнологией как ярким примером интеграционных взаимодействий научных дисциплин. Хронология развития биотехнологии. Основные биотехнологические процессы в пищевой промышленности допастеровской эры.

2. Развивающая а) развитие познавательного интереса учащихся при знакомстве с данным направлением человеческой деятельности;

б) формирование логического мышления в ходе изучения нового материала;

в) формирование умений и навыков умственного и практического труда.

3. Воспитательная: а) в целях формирования диалектического мировоззрения показать познаваемость природы, на примере влияния человека на биотехнологические процессы пищевой промышленности;

б) воспитание такта и дисциплины на занятиях в общеобразовательном учреждении.

Ход урока:

1. Организация класса

2. Актуализация знаний

Биотехнология - что это такое? (мнения учащихся)

Биотехнология - использование в промышленности биологических систем или процессов (под запись).

Важно то, что человек смог создать самолет по принципу птицы, многоотсечные подводные лодки по принципу кольчатых червей (бионика - подражание природе), но даже не смог приблизиться к уникальности биологических систем в отношении узнавания и катализа (вспомните специфичность и активность ферментов).

Человек использовал биотехнологию многие тысячи лет: люди занимались пивоварением, пекли хлеб. Они придумали способы хранения и переработки продуктов путем ферментации (сыр, уксус), изготавливали простейшие лекарства и т.д. Однако только разработка методов генетической инженерии привела к «биотехнологическому буму», свидетелями которого мы являемся.

3. Изучение нового материала

Но пойдем по порядку.

В своем современном варианте биотехнология, пожалуй, наука синтетическая:

Но у вас не должно быть мнение о ней как о прикладной дисциплине: «Нет и еще тысячу раз нет: я не знаю такой науки, которую можно было бы назвать прикладной. Есть наука и есть области её применения, и они связаны друг с другом, как плод с взрастившим его деревом» (Луи Пастер, 1871 г.)

Съезд европейской ассоциации биотехнологов разделил развитие биотехнологии на пять этапов: (под запись) [16]

1) допастеровская эра (до 1865 года) - самобытные производства пива, вина, хлеба, сыра;

2) послепастеровская (1866-1940) - производство органических кислот, растворителей, кормовых дрожжей, вакцин, очистка сточных вод.

В конце 19 века Луи Пастер установил, что микробы играют ключевую роль в процессах брожения, и показал, что в образовании отдельных продуктов участвуют разные их виды;

3) эра антибиотиков (1941-1960) - началом которой послужило открытие Александром Флемингом способности Penicillium вызывать гибель микроорганизмов;

4) эра управляемого биосинтеза (1961-1975) - производство аминокислот, витаминов, ферментов. Достижения, главным образом, селекции и биохимии микроорганизмов;

5) эра генетической инженерии (70-е годы) - технология гибридных ДНК.

Сегодня мы разберем основные процессы допастеровской эры - производство некоторых продуктов питания (таблица выполняется на доске).

4. Вывод

Итак, изменилось ли ваше представление о биотехнологии, производстве продуктов питания?

УРОК №2 по теме «Биологическая переработка отходов»

Задачи:

1. Образовательная: изучение основ получения биогаза и очистки сточных вод. Знакомство с экологической биотехнологией.

2. Развивающая: а) развитие познавательного интереса при знакомстве с новым направлением биотехнологии;

б) формирование логического мышления в ходе систематизации материала;

в) формирование умений и навыков умственного и практического труда.

3. Воспитательная: а) в целях формирования диалектического мировоззрения показать использование человеком процессов и объектов живой природы для нужд общества;

б) воспитание мотивации к обучению в связи актуальности экологических проблем в современном мире.

Ход урока:

1. Организация класса

Вспомните, какой этап развития биотехнологии мы разобрали на предыдущем уроке?

Какой химический процесс лежит в основе всех бродильных(спиртовых) производств?

2. Актуализация знаний

Ни для кого из вас не секрет, что человек в ходе своей деятельности создает большую экологическую нагрузку окружающей среде (примеры учащихся). И здесь биотехнология внесла и вносит свой вклад. Под запись: специфическое применение биотехнологических методов для решения проблем окружающей среды, таких как переработка отходов, очистка воды, устранение загрязнений, составляет предмет экологической биотехнологии.

3. Изучение нового материала

(Основная часть урока проходит в форме лекции, позволяющей компактно передать учащимся укрупненную дидактическую единицу)

На сегодняшнем уроке мы «займемся» бытовыми отходами.

Необходимо отметить, что проблемой очистки сточных вод занялись только в 1890 году, когда был предложен первый биофильтр. Вообще, все биологические методы очистки сточных вод основаны на использовании закономерностей самоочищения водоемов.

Для очистки используют:

а) биофильтры - сточные воды пропускают через слой крупнозернистого материала, покрытого тонкой бактериальной пленкой, благодаря которой интенсивно протекают процессы биологического окисления. С 1970 года на смену клинкеру и гравию в качестве пористого материала пришли пластмассы. Таким образом, видим сочетание механической (пористый носитель) и биологической (биодеградация органических остатков) очистки сточных вод. Недостаток - избыточный рост микроорганизмов и, как следствие, засорение фильтра.

б) биологические пруды - отстойные цветущие водоемы. Характеризуются малой эффективностью и большим временем самоочистки.

в) аэротенки - известны с 1914 года. Именно 1914 год считается годом рождения биоочистки сточных вод. Аэротенки - это огромные резервуары из железобетона, в которых очистка происходит с помощью активного ила из бактерий (Zoogloea) и микроскопических животных. Процесс очистки непрерывный, аэробный, т.е. нуждается в активной аэрации воздухом (отсюда высокие эксплуатационные расходы) и высоко эффективный.

г) «псевдоожиженный слой» - применяется с 1980 года по сей день. «Псевдоожиженный слой» - это сочетание биофильтра и активного ила. Подложка - полимерный носитель или песок. Процесс периодический и не требует аэрации. После биоочистки проводят дезинфекцию жидким хлором, хлорной известью, УЗ, озоном или электролизом.

Каким бы способом не проводилась биоочистка сточных вод, в конце имеем избыточную биомассу. Наиболее эффективный способ утилизации - анаэробное брожение с получением биогаза.

Биогаз - смесь 65% СН4; 30% СО2; 1% Н2S … NH3 …

Энергия 1,7м3 биогаза эквивалентна энергии 1м3 природного газа. В основе получения биогаза лежит процесс метанового брожения или биометаногенез. Биометаногенез - сложный микробиологический процесс разложения органического вещества до СО2 и СН4 в анаэробных условиях (под запись).

Участвуют свыше 190 микроорганизмов.

Стадии:

90-95% используемого углерода превращается в метан, остальное в биомассу. Температура процесса 30-60?С; рН ~ 7. Основное преимущество биогаза - возобновляемый и экологически чистый источник энергии.

4. Вывод

Итак, что же мы сегодня изучили? Какую роль, по вашему мнению, может сыграть технология биометаногенеза в ближайшем будущем в свете дефицита энергоносителей?

УРОК №3 по теме «Бактериальное выщелачивание»

Задачи:

1. Образовательная: расширить сведения учащихся о переработке отходов на примере использования промышленных отвалов. Рассмотрение основных процессов микробного выщелачивания. Промышленное использование на примере переработки медных отвалов.

2. Развивающая: а) развитие познавательного интереса в процессе знакомства с материалом;

б) формирование логического мышления в ходе дедуктивного изложения материала;

в) формирование умений и навыков умственного и практического труда.

3. Воспитательная: а) в целях формирования диалектического мировоззрения показать, что, при всей необычности процессов микробного выщелачивания, они закономерно вписываются во всеобщую биотрансформацию неорганических веществ;

б) «прививание» экологического мировоззрения.

Ход урока:

1. Организация класса

Какие виды очистки сточных вод вы можете назвать? Как вы понимаете понятие биометаногенез?

2. Актуализация знаний

Еще за 1000 лет до н.э. финикийцы извлекали медь из рудничных вод. Валлийцы (Британские острова) в 17 веке описали аналогичный процесс. Сегодня мы попытаемся разобраться в секрете древних металлургов. Тема урока: «Бактериальное выщелачивание».

3. Изучение нового материала

1947 г. - Колмер и Хинкл выделили из шахтных вод бактерию Thiobacillus ferrooxydans. Попытайтесь перевести название на русский язык («Серобацилла железоокислительная»).

И действительно этот вид осуществляет процесс:

Fe2+ Fe3+, что соответствует окислению железа.

Данный вид бактерий относиться к группе хемосинтезирующих автотрофов (вспомните, что это такое), открытых Виноградским в 1920-е годы. Позже были обнаружены Thiobacillus thiooxydans - организмы, живущие в среде при рН = 0,65, и Sulfolobus, «терпящие» до 85?С. Эти бактерии существуют за счет окисления серы.

T.ferrooxydans

4Fe2+ + O2 + 4H+ 4Fe3+ + 2H2O

Sulfolobus

S8 + 12O2 = 8 H2O 8H2SO4

T.thiooxydans

ZuS + 2O2 ZuSO4

T. ferro-/thiooxydans

4FeS2 + 15O2 + 2H2O 2Fe2 (SO4)3 + 2H2SO4

Обратите на последние два процесса особое внимание, так как данные процессы «растворения» минералов сфалерита (ZuS) и пирита (FeS2) идут в земной коре и могут быть использованы человеком как альтернатива

t

2ZuS + 3O2 = 2ZuO +2SO4, дающего много загрязнителей атмосферы.

Особый интерес для промышленности представляет перевод в раствор полудрагоценной меди:

Cu2S + 4Fe3+ = 2Cu2+ + 4Fe2+ + S

T.ferrooxydans Sulfolobus H2SO4

Данный процесс позволяет перерабатывать бедные руды и отвалы с содержанием меди 0,4% (w).

Возможные схемы проведения

Продукт: р-р, содержащий 0,75 - 2,2 г/л меди:

Cu2+ + Fe = Cu + Fe2+ (можно показать меднение гвоздя в растворе медного купороса)

Образующийся раствор Fe2+ снова направляют в отвал.

· Проблемы:

1) Бактерии живут только в кислой среде. Что будет происходить при контакте выщелачивающего раствора с известковыми породами?

2) Потери раствора и возможное смешивание с грунтовыми водами.

3) Разогревание породы при «работе» бактерий (зафиксировано до 80?С) и как следствие стерилизация.

4) Инженерные проблемы введения кислоты и воздуха в породу.

· Перспективы:

1) Удаление серы из каменного угля. Подумайте, как это можно сделать.

2) Извлечение металлов из морской воды (Au) - привлечение ГМО.

4. Вывод

Итак, при желании человек может применять природосберегающие технологии даже при разработке медных, и не только, руд.

УРОК №4 по теме «Основы получения БАВ. Производство кормового белка»

Задачи:

1. Образовательная: изучение основных механизмов интенсификации процессов получения продуктов клеточного метаболизма. Производство кормового белка как предшественник управляемого биосинтеза БАВ.

2. Развивающая: а) развитие познавательного интереса учащихся;

б) формирование логического мышления в ходе изучения механизмов интенсификации процессов получения продуктов клеточного метаболизма;

в) формирование умений и навыков умственного и практического труда.

3. Воспитательная: а) в целях формирования диалектического мировоззрения показать возможность воздействия человека на процессы клеточного метаболизма;

б) воспитание мотивации к обучению.

Ход урока:

1. Организация класса

Напишите уравнения химических процессов лежащих в основе микробиологического выщелачивания медных отвалов, руд, содержащих пирит.

2. Актуализация знаний

Всем вам хорошо известны витаминные препараты, продающиеся повсеместно в аптеках. Антибиотики как средство от многих возбудителей заболеваний прочно вошли в нашу жизнь. Встает вопрос, какими методами получают в промышленности все эти соединения. Прежде, чем говорить о получении, вспомним, что из себя представляет предмет нашего разговора.

3. Изучение нового материала

Витамины - группа низкомолекулярных природных органических соединений, абсолютно необходимых для гетеротрофных организмов (что это за организмы?). Автотрофные организмы обладают способностью к синтезу витаминов. (под запись)

Антибиотики - низкомолекулярные регуляторы обычно природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток.

Итак, в процессе роста организмы вырабатывают различные низкомолекулярные (какие ещё вы знаете?) продукты (метаболиты). Они подразделяются на первичные (абсолютно необходимы) и вторичные (не требующиеся для выживания).

Таким образом, вторичные метаболиты повышают адаптационные возможности организмов.

масса организма I - первичные метаболиты

II - вторичные (синтезируются

на завершающей стадии роста)

время роста

К каким метаболитам вы отнесете аминокислоты, углеводы? Почему?

В норме обмен веществ в клетке осуществляется по принципу строжайшей экономии. Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма, что обеспечивается следующими методами:

1) Изменение генетической программы организма:

а) селекция - направленный отбор организмов со скачкообразным изменением генома. Но для возникновения мутации интересующий нас ген должен удвоиться ~107 раз.

б) искусственный мутагенез - химический, УФ, радиационный.

2) Нарушение регуляторных систем организма: (на доске)

Сегодня мы рассмотрим также производство кормового белка как прообраз современного управляемого биосинтеза аминокислот, витаминов и антибиотиков.

В соответствии с нормами питания человек должен ежедневно получать с пищей 60-120 г. полноценного белка (содержащего все незаменимые аминокислоты). Незаменимые аминокислоты наиболее сбалансированы в белках семян сои, также риса и гороха. В белках зерна пшеницы мало лизина, метионина и изолейцина.

Особый интерес представляет использование микроорганизмов в качестве источника белка и витаминов:

1) использование разнообразных сред для культивации (вплоть до отходов производства);

2) высокая интенсивность роста

удвоение белковой массы: крупный рогатый скот - 5 лет,

свиньи - 4 месяца,

дрожжи - 1-6 часов;

3) повышенное содержание незаменимых аминокислот;

4) относительная простота влияния на процессы синтеза.

Дрожжевые клетки способны использовать жидкие фракции углеводородов нефти (10-30?С). В России первый завод по производству кормовых дрожжей из жидких парафинов нефти вступил в действие в 1971 году. При выращивании в среду добавляют также минеральные соли, витамины и воду. Полученная высушенная дрожжевая масса гранулируется и используется как белково-витаминный концентрат (БВК), содержащий до 60% белковых веществ.

Хорошим субстратом для выращивания кормовых дрожжей является молочная сыворотка - отход при переработке молока, а также низшие спирты. Хороший резерв пищевого белка и витаминов - остаточные пивные дрожжи. Организм человека усваивает свыше 90% питательных веществ, содержащихся в них.

Известно также более 30 видов бактерий, которые могут быть применены в качестве источника полноценного белка. Например, водородоокисляющие бактерии способны накапливать в клетках до 80% сырого протеина (среда 75% Н2, 20% О2, 5% СО2).

Используются также одноклеточные водоросли (Chlorella, Seenedesmus). Обычно их выращивают в естественных условиях южных регионов в бассейнах открытого типа (70 т/га в год).

Микопротеин - белок грибного происхождения. Среда культивации - глюкозный сироп (гидролизат кукурузного крахмала).

4. Заключение

Итак, острота проблемы глобального перенаселения, сокращение с/х площадей в результате роста городов и деградации земель выводит нас на новый виток развития биотехнологии, а именно, крупномасштабное использование микроорганизмов для наработки белково-витаминной продукции.

УРОК №5 по теме «Производство аминокислот, витаминов и антибиотиков»

Задачи:

1. Образовательная: изучить примеры некоторых производств аминокислот, витаминов и антибиотиков. Другие промышленно важные процессы эры управляемого биосинтеза: производство лимонной и молочной кислот.

2. Развивающая: а) развитие познавательного интереса учащихся в процессе ознакомления с материалом;

б) формирование логического мышления;

в) формирование умений и навыков умственного и практического труда.

3. Воспитательная: а) в целях формирования диалектического мировоззрения показать использование человеком природных систем для получения некоторых БАВ;

б) воспитание мотивации к обучению в связи с важностью биотехнологических методов в современной химической промышленности.

Ход урока:

1. Организация класса

Какие компоненты используются при получении БВК?

2. Актуализация знаний

На предыдущем уроке мы познакомились с возможными путями обеспечения сверхсинтеза одного их продуктов метаболизма (какими?), а сегодня попытаемся рассмотреть конкретные производства.

3. Изучение нового материала

I. Производство аминокислот

Среди соединений, полученных биотехнологическими методами, аминокислоты занимают первое место по объему производства (500 тыс. т/год).

Белковые аминокислоты можно получить:

1) гидролизом природного белоксодержащего сырья, но кислотное воздействие разрушает некоторые аминокислоты;

2) химическим синтезом, в ходе которого получается трудноразделимая смесь целевого продукта и его аналогов;

3) микробиологическим синтезом, который обеспечивается возобновляемым сырьем и характеризуется строгостью чистоты получаемого продукта. Более 60% производимых аминокислот получают именно этим методом.

Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности некоторых микроорганизмов выделять в культурную среду значительные количества какой-либо аминокислоты (1955). Corynebacterium glutamicum был способен, кроме того, к сверхсинтезу глутамина, и в 1956 году этот микроорганизм был использован при организации первого в мире производства глутаминовой кислоты (НООС-СН2-СН2-СН(NH2) COOH). Сейчас на глутамат натрия приходится 300 тыс. т/год, т.е. 60% производства аминокислот. Японцы называют глутамат натрия «солью вкуса», т.е. он значительно продлевает вкусовые ощущения.

Лизина производится 100 тыс. т/год. Данная аминокислота H2N(CH2)4CH(NH2) COOH - незаменимый компонент питания с/х животных. В клетках микроорганизмов лизин служит конечным продуктом разветвлённого метаболического пути, и эффекта накопления в среде целевой аминокислоты добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных продуктов. Получаемые мутанты дефектны по ферменту разветвления метаболического пути, в результате чего накапливается только лизин. В качестве питательной среды используют молочную сыворотку или гидролизаты крахмала.

Некоторые аминокислоты синтезируют из предшественников, полученных химически и модифицированных ферментной системой организма (триптофан получают из антраниловой кислоты).

II. Производство витаминов

В настоящее время микробиологически синтезируют лишь особо сложные по строению витамины (В2, В12, ?-каротин, D). Остальные либо синтезируют химическим путем, либо выделяют из природных источников.

Витамин В2 (рибофлавин) вплоть до 30-х годов 20 века выделяли из природного сырья (1г из 1т моркови и 6г из 1т печени трески). В 1935 году был обнаружен активный продуцент рибофлавина - гриб Eremothecium, способный давать с 1т питательной среды 25 кг витамина. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В2.

Витамина В12 из 1т печени трески можно было выделить лишь 15 мг. В настоящее время витамин В12 синтезируется только микробиологическим путем с использованием актиномицетов и одноклеточных водорослей.

?-каротин можно выделить из ряда растительных объектов: 1т моркови содержит 0,06 мг витамина, в то время как биомасса гриба Blaneslea накапливает ?-каротин в количестве 8 мг/г.

III. Получение органических кислот

Объем мирового производства лимонной кислоты НООССН2С(ОН) (СООН) СН2СООН - 400 тыс. т/год. Данное производство относится к старейшим микробиологическим процессам: 1893 г. - год основания. Используют культуру гриба Aspergillus niger. Условиями высокого выхода лимонной кислоты является хорошая аэрация и дефицит фосфата в среде.

Одновременно с лимонной было налажено аналогичное производство молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий Lactobacillus.

IV. Получение антибиотиков

Вспомните, что такое антибиотики? Думаю, важность получения соединений данной группы нет необходимости доказывать.

В 1940 году было известно всего 6 антибиотиков, а в настоящее время описано свыше 12 000 соединений, из которых в клинике используется около 200 (остальные токсичны).

Биосинтез антибиотиков осуществляется:

1) добавлением в питательную среду подходящего предшественника (фенилуксусная кислота стимулирует биосинтез бензилпенициллина);

2) использованием блокированных мутантов, у которых отсутствует определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу антибиотика. Следовательно, можно получить аналоги антибиотиков и модифицировать их химически (бензилпенициллин, ампицилин).

4. Вывод

Пока человек лишь приближается к моделированию природных биохимических процессов, а пока изыскивает новые пути использования существующих.

УРОК №6 по теме «Применение ферментов»

Задачи:

1. Образовательная: знакомство с иммобилизованными ферментами. Промышленное применение иммобилизованных ферментов.

2. Развивающая: а) развитие познавательного интереса;

б) формирование логического мышления в ходе знакомства с методами иммобилизации ферментов;

в) формирование умений и навыков умственного и практического труда.

3. Воспитательная: а) в целях формирования диалектического мировоззрения показать использование катализаторов белковой природы;

б) воспитание мотивации к обучению при акцентировании на современности и важности данной методики работы с ферментными препаратами.

Ход урока:

1. Организация класса

Какими способами можно получить белковые аминокислоты? Попытайтесь написать реакцию гидролиза белка в общем виде.

2. Актуализация знаний

Всем хорошо известно, что в морской воде много растворенного кислорода, но, тем не менее, его использование затруднено, и при погружении приходится использовать дополнительные источники кислорода. А что, если гемоглобин, выделенный из крови, использовать в качестве посредника между морской водой и газовой средой дыхательного аппарата?! Более того, модель «гемогубки» уже предложена и, возможно, в ближайшем будущем будут сконструированы эффективные искусственные жабры. Сегодня на уроке мы попытаемся разобраться, каким образом можно «направить в нужное русло» тот или иной фермент.

3. Изучение нового материала

Ферменты сохраняют свои уникальные свойства (какие?) и вне клеток, поэтому их традиционно широко применяют в практике.

Применение ферментов

Но если смешать фермент с реагентами, то после окончания реакции его будет очень трудно отделить от продуктов. Еще в 1916 году Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахараза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую активность, а уголь можно отделить от раствора продуктов без особых затруднений, и, следовательно, фермент можно применять многократно.

В настоящее время (с 1971 года) применяется термин «иммобилизация» - полное или частичное ограничение движения белковых молекул. Иммобилизованными ферментами называют ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства (под запись). Иммобилизованный ферментный препарат включает в себя непосредственно фермент и носитель (природные полимеры - целлюлоза, хитин, желатин; синтетические - полистирол, поливиниловый спирт; неорганические - керамика, силикагель, графит).

Примеры химической иммобилизации:

1) образование амидной связи:

H - C(O) Cl + H2N - Ф = H - C(O) NHФ + HCl

2) образование дисульфидного мостика:

H - SH + 0,5O2 +HS - Ф = H - S - S - Ф +Н2О

3) образование оснований Шиффа:

H - C(O) H + H2N - Ф = H - CH = N - Ф + Н2О

Промышленное применение иммобилизованных ферментов:

1. Иммобилизованная сахараза работает до 10 лет, при этом активность фермента теряется незначительно:

С12Н22О11 + Н2О = С6Н12О6 + С6Н12О6

глюкоза фруктоза

инвертный сахар

2. Глюкоизомераза превращает глюкозу во фруктозу и таким образом получают глюкозо-фруктозный сироп (50 х 50).

3. Осуществлен промышленный синтез аминокислот из их аналогов на иммобилизованных ферментах:

НООС - СН = СН - СООNH4 HOOC - CH2 - CH(NH2) - COOH

фумарат аммония аспарагиновая кислота

HOOC - CH2 - CH(NH2) - COOH H3C - CH(NH2) - COOH + CO2

аспарагиновая кислота аланин

4. Яблочную кислоту - заменитель лимонной в продуктах питания - получают из химически синтезируемой фумаровой:

НООС - СН = CH - СООН + Н2О НООС - СН(ОН) - СН2СООН

фумаровая кислота яблочная кислота

4. Заключение

Итак, нам стало ясно, какое значение играют ферменты в современной химической промышленности. На следующем уроке мы попробуем сами получить иммобилизованный ферментный препарат.

УРОК №7 Практическая работа «Приготовление иммобилизованных ферментных препаратов»

Задачи:

1. Образовательная: освоение простейших методов получения ферментных препаратов в растворенном и иммобилизованном виде.

2. Развивающая: а) развитие познавательного интереса учащихся;

б) формирование логического мышления в ходе выполнения практической работы;

в) формирование умений и навыков умственного и практического труда.

3. Воспитательная: а) в целях формирования диалектического мировоззрения проведением качественных проб на ферменты показать реальность процесса иммобилизации;

б) воспитание мотивации к обучению.

Ход урока:

1. Организация класса

Какие способы иммобилизации ферментов вы знаете?

2. Постановка учебных задач

На сегодняшнем занятии вы попробуете самостоятельно выделить фермент из природного объекта и иммобилизовать его на полимерном носителе.

Класс делится на 3 группы, и каждая работает со своим ферментом.

3. Проведение работы (более подробно см. [13].

I. Получение ферментных препаратов:

10 г. природного объекта (пекарские дрожжи - сахараза; бобы фасоли без кожуры - уреаза; проростки пшеницы - комплекс амилаз) тщательно растирается в ступке с кварцевым песком и заливается 20-30 мл воды; перемешивание - 10 мин. Фильтрование через складчатый фильтр.

II. Иммобилизация:

После пояснения термина «катионит» берут 1 г его и в химическом стакане перемешивают с полученным ранее фильтратом 40-60 мин. После фильтрования (обычный фильтр) массу промывают 2 раза водой.

III. Проведение качественных проб:

(Заранее на доске приготовлена таблица)

Контроль выполняют 3 человека из класса со смоченным водой катионитом.

4. Выводы

Итак, что вы можете сказать после проведения качественных реакций? Почему катионит не дал положительных результатов в контрольных опытах? Оформите дома работу, попробуйте написать химический процесс, катализируемый «вашим» ферментом, и ответьте на вопрос: какой вид иммобилизации мы использовали в ходе работы?

УРОК №8 по теме «Основы генной инженерии»

Задачи:

1. Образовательная: знакомство с современной биотехнологией - генетической инженерией, основные направления и задачи. Принципиальные методы создания искусственных генетических структур.

2. Развивающая: а) развитие познавательного интереса учащихся;

б) формирование логического мышления в процессе освоения теоретических приемов конструирования генетических структур;

в) формирование умений и навыков умственного и практического труда.

3. Воспитательная: а) в целях формирования диалектического мировоззрения показать познаваемость тонких механизмов реализации генетической программы организма и возможности воздействия человека на геномы различных живых объектов;

б) воспитание мотивации к обучению.

Ход урока:

1. Организация класса

Обсуждение вопросов, возникнувших при оформлении практической работы.

2. Актуализация знаний

«…там, где природа кончает производить свои виды, там человек начинает из природных вещей создавать, с помощью этой же самой природы, бесчисленные виды новых вещей». (Л. Да Винчи: расшифрованные записные книжки)

С глубокой древности человек мечтал создавать новые виды животных … людей. Достаточно вспомнить множество мифов о русалках, кентаврах, сиренах и других сказочных (?!) персонажах. Кто знает, может в недалеком будущем они станут реальностью.

На сегодняшнем уроке мы попытаемся разобраться, что служит основанием для таких суждений.

3. Изучение нового материала

Если вы вспомните первое занятие, то сами скажете, в какой «биотехнологической эре» мы сейчас живем (эра генетической инженерии).

Попробуем разобраться в этом термине:

генетическая (генная) - затрагивающая генетические структуры (какие это структуры?);

инженерия подразумевает конструирование, модификацию в механическом смысле.

Итак, запишите определение:

Генная инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем искусственные генетические структуры, вводить их в клетку и позволяющих в ней совершать работу.

Возможно, у вас вызвало недоумение словосочетание «совершать работу». Вспомним простейшую схему реализации генетической информации:

участок ДНК (ген) РНК белок (на доске)

и именно белок реализует генетическую информацию сам по себе или, если он фермент, запускает превращение каких-то веществ. Например, собаки не нуждаются в поступлении извне витамина С, а синтезируют его из компонентов углеводистой пищи. Следовательно, если гены, кодирующие нужные ферменты такого превращения, «пересадить» от собаки организму, испытывающему недостаток витамина С (морской свинке, человеку!?!), то проблема будет решена. Правда, данный перенос генов на современном этапе утопичен, но я привел его как наглядный пример биотехнологического использования.

Успехи в генной инженерии стали возможны благодаря изучению простейших живых существ (вирусов и бактерий) на генетическом уровне. Прежде, чем извлечь нужный ген из микроорганизма, надо знать его местоположение. Составлены так называемые генетические карты многих штаммов бактерий и вирусов методами классической генетики. Нужен «почтальон» - носитель генов, предназначенных для переноса («вектор»). Такие имеются в природе с незапамятных времен: плазмиды и бактериофаги. Плазмиды - кольцевые молекулы ДНК, относительно небольших размеров, самостоятельно существующие независимо от хромосомы бактерии. Они обусловливают вне хромосомную наследственность (кстати, у человека её обусловливают митохондрии). И конечно нужны «хирургические скальпели» молекулярных размеров, позволяющие резать ДНК в нужных местах. И такие инструменты всегда были рядом с нами и даже в нас: ферменты специфического расщепления ДНК - рестриктазы. Роль их в клетке - разрушение вирусных ДНК. Каждая рестриктаза специфична по-своему, но все они имеют одну общую особенность - действуют на последовательности, читаемые в одной цепи ДНК, идентично другой, но в противоположную сторону:

5? ГААТТЦ 3?

5? ЦТТААГ 3?

«перевертыши»: «А роза упала на лапу Азора».

Обратите внимание, что образовались однотяжевые последовательности, комплементарные друг другу, «липкие концы». Уже известно более 500 рестриктаз, позволяющих расщеплять ДНК в 120 последовательностях. Впервые их применили в 1972 году в США.

Есть ферменты, сшивающие разрывы ДНК (на доске):

Теперь обновленные плазмиды, поглощенные бактериями из раствора, можно размножить в миллионы раз - клонировать. А встроенный ген будет работать и нарабатывать нужный белок, витамин, аминокислоту… Это мы рассмотрим на следующем уроке.

УРОК №9 по теме «Применение генной инженерии»

Задачи:

1. Образовательная: знакомство учащихся с применением достижений генной инженерии в биотехнологии: клонирование генов в различных организмах. Проблемы и перспективы данного направления.

2. Развивающая: а) развитие познавательного интереса учащихся в связи с занимательностью материала;

б) формирование логического мышления в ходе познания путей получения современных лекарственных препаратов и новых сортов растений;

в) формирование умений и навыков умственного и практического труда.

3. Воспитательная: а) в целях формирования диалектического мировоззрения показать хрупкость состояния природного равновесия и все возрастающую роль человека в поддержании этого равновесия;

б) воспитание мотивации к обучению.

Ход урока:

1. Организация класса

Объясните, как можно пересадить ген от одного микроорганизма другому?

2. Актуализация знаний

Итак, мы разобрались, как можно пересадить ген от одного организма другому. Сегодня посмотрим, к чему это приводит или может привести.

3. Изучение нового материала

В настоящее время основные работы по генной модификации организмов ведутся с бактериями, так как они наиболее изучены и просты. Многие штаммы микроорганизмов также являются сверхпродуцентами различных биологически активных веществ.

Материал к уроку смотри клонирование в клетках различных организмов(главаI).

«Мы почувствовали себя ничтожными существами, богохульно дерзнувшими затронуть силы, бывшие до сих пор в неприкосновенности». (Генерал Фарелл, очевидец взрыва первой экспериментальной атомной бомбы 16.07.1945)

УРОК №10 Итоговая проверочная работа

I вариант

1. Определение биотехнологии

2. Принцип работы биофильтра, аэротенка

3. Напишите уравнения реакций микробиологического окисления пирита, выщелачивания медных отвалов

4. Определение иммобилизованного фермента. Методы иммобилизации.

5. Что такое генная инженерия?

II вариант

1. Этапы развития биотехнологии

2. Уравнения процессов молочнокислого и спиртового брожения, получения уксуса

3. Определение биометаногенеза, этапы

4. Принцип отбора мутантов с нарушениями регуляторных систем

5. Как вы понимаете понятия: вектор, рестриктазы

3.3 Примерный план включения материала элективного курса в темы неспециализированной программы по химии

3.4 Педагогический эксперимент

Приведённая практическая работа была выполнена на занятиях школы №18 со школьниками 10 «А» и 10 «Б» и со студентами 5 курса биолого-химического факультета КГПУ им. К.Э. Циолковского.

Занятие по теме «Микробиологическое выщелачивание» было также проведено со студентами (БХ-51) за невозможностью использования резервов школы.

Кроме того, был изучен и переработан опыт учителей средней школы №18 г. Калуги в преподавании темы «Биотехнология». Данная тема затрагивается ими в 11 классе в модуле «Химия в жизни общества» (по программе О.С. Габриеляна).

Вывод

Педагогический эксперимент выявил некоторые технические и временные недостатки предлагаемой практической работы. По нашему мнению целесообразнее её проводить во внеурочное время: на факультативных занятиях и кружках.

В ходе беседы была выявлена заинтересованность студентов в предложенном материале. Несомненно, данное занятие расширило их кругозор и мотивировало к дальнейшему обучению.

Учитель химии средней школы №5 г. Калуги также считает нужным расширение предложенного О.С. Габриеляном модуля за границы лекарственных препаратов.

Заключение

В процессе работы для достижения цели нами были выполнены следующие задачи:

1. Проанализирована методическая литература и обоснована актуальность темы.

2. Проанализирована литература, дающая обзор основных вопросов биотехнологии.

3. Подобран материал к проведению уроков по данной теме и разработаны методические рекомендации по его использованию.

4. Подобрана лабораторная работа, которую следует включить в изучение данной темы.

5. Проведён педагогический эксперимент и освоен опыт учителей.

Таким образом, разработанная нами методика применима для обучения, так как повышает познавательный интерес у учащихся, что является важным условием формирования высокого качества знаний и эффективности их усвоения. Кроме того, предложены опыты, не требующие применения сложного оборудования.

Список литературы

1. Андреева Н.В., Левченко А.Л. Профильное обучение: вчера, сегодня, завтра // Биология в школе, №5, 2004-с. 21

2. Баранов В.С. Генная терапия - медицина XXI века // Соросовский образовательный журнал, №3, 1999-с. 63

3. Белозёрский А.Н. Молекулярная биология - новая ступень познания природы - М., «Советская Россия», 1970

4. Биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ. // Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста и Дж. Джонса. - М.: Мир, 1988. - 480 с.

5. Браун А.Д. Фаддеева М.Д. Молекулярные основы жизни - М.: «Просвещение», 1976 - 206 с.

6. Геном, клонирование, происхождение человека // общ. ред. Корочкина Л.И. - Фрязино, 2004

7. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии - М.: «Академия», 2003 - 208 с.

8. Ингрем В. Биосинтез макромолекул Пер. с англ. - М.: Мир 1966 -273 с.

9. Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология - М.: «Академия», 2003. - 400 с.

10. Концепция модернизации российского образования на период до 2010 года

11. Ленинджер А. Основы биохимии: в 3-х томах Т.3. Пер. с англ.-М.: Мир, 1985. - 320 с.

12. Лутова Л.А. «Генетическая инженерия растений: свершения и надежды» // Соросовский образовательный журнал, том 6, №10, 2000 - с. 10

13. Николаев А.А. Основы биотехнологии часть I Калуга, КГПИ им. Циолковского. 1989. - 43 с.

14. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. - М.: Просвещение, 1987. - 815 с.

15. Программы для общеобразовательных учреждений: химия 8-11 кл. // сост. Габрусева Н.И., Суматохин С.В. - М.: Дрофа, 2001 - 288 с.

16. Садовникова Е.А., Шакир И.В. «Биотехнология - что это такое?» // Химия в школе №2 1994

17. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии Высш. шк., 1985. - 503 с.

18. Франк-Каменецкий М.Д. Самая главная молекула - М.: Наука 1988. - 176 с.

19. Чирков Ю.Г. «Время химер. Большие генные игры». - М.: ИКЦ «Академкнига» 2002.

20. http://www.pravda.ru/science/technologies/209660-egg-0

21. http://www.vz.ru/society/2006/10/17/53162.html