|
|
|
 |
Методы диагностики и профилактики микробной контаминации при трансплантации эмбрионов |
|
 |
БОЛЬШАЯ ЛЕНИНГРАДСКАЯ БИБЛИОТЕКА - РЕФЕРАТЫ - Методы диагностики и профилактики микробной контаминации при трансплантации эмбрионов
Методы диагностики и профилактики микробной контаминации при трансплантации эмбрионов
Введение1. Обзор литературы1.1 Состояние и перспективы применения метода трансплантации эмбрионов1.2 Чувствительность матки к инфекциям в разные периоды полового цикла1.3 Предупреждение заноса инфекции в матку при извлечении и пересадке эмбрионов1.4 Влияние микроорганизмов на спермии, яйцеклетки и эмбрионы1.5 Влияние антибиотиков на спермии, яйцеклетки, эмбрионы2. Собственные исследования2.1 Цель и задачи2.2 Материалы и методика исследований2.2.1 Подготовка лаборатории, посуды и инструментов для манипулирования с эмбрионами2.2.2 Подготовка доноров и реципиентов2.2.3 Извлечение и подготовка эмбрионов к пересадке2.2.4 Влияние микробного фактора на приживляемость эмбрионов2.3 Анализ экономической деятельности предприятия2.4 Характеристика предприятия2.5 Результаты исследований2.5.1 Разработка мер предупреждения микробной контаминации эмбрионов на технологических этапах их подготовки2.5.2 Экономическая эффективность ветеринарных мероприятий2.6 Обсуждение результатов собственных исследований3. Охрана труда3.1 Организация охраны труда3.2 Производственная санитария3.3 Пожарная безопасностьВыводы и предложенияВыводыПредложения производствуСписок литературы ВведениеСовременные темпы развития животноводства требуют совершенствования существующих методов селекционной работы с целью создания и ускоренного размножения высокопродуктивных животных (А.П. Студенцов и др. 2000). Более интенсивное использование репродуктивного потенциала ценных в племенном отношении женских особей возможно при трансплантации эмбрионов.Одним из главных условий успешного применения метода трансплантации эмбрионов в животноводстве является асептичность проводимых операций (A. Brand et al., 1978; H. Kupferschmid; 1984 E. Singh, 1985; А. Овчинников, 1985; Ф.И. Осташко и соавт., 1986).В технологии трансплантации эмбрионов важное место отводится разработке методов, предупреждающих возможность контаминации их патогенной микрофлорой, которые обеспечивают получение здоровых телят и профилактируют появление гинекологических болезней, в частности, эндометритов как у коров - доноров, так и у реципиентов.При манипулировании с эмбрионами вне организма нельзя допускать их инфицирования и переноса микроорганизмов в матку реципиента (M. Tibier, 1985; I. Atwell, 1987). Бактериальному загрязнению эмбрионы подвергнуты и при их оценке. Многие авторы утверждают, что как яйцеклетка, так и эмбрион с интактной зоной пеллюцида надежно защищены от микробного фактора, тем не менее, некоторые из них рекомендуют многократное отмывание эмбрионов в стерильных буферных средах или в средах с добавлением ферментов (R.A. Bowen et al., 1983; E. Singh et al., 1982; 1983; W. Hare et al., 1984). Именно поэтому руководством международного общества по пересадке эмбрионов (Manual of the international embryo transfer, 1986) предусмотрен санитарный контроль их качества.В нашей стране и за рубежом ведутся интенсивные работы по разработке оптимальных способов трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Продолжаются исследования по совершенствованию гигиенических и технических приемов получения и пересадки эмбрионов.Анализ литературных данных показал целесообразность исследований по совершенствованию гигиенических приемов при трансплантации эмбрионов. Это продиктовано недостаточным количеством противоречивых данных о влиянии микроорганизмов на приживлямость эмбрионов. Существует мнение, что внесение инфекции в матку с пистолетом Кассу не является причиной яловости, если в остальном соблюдена асептика (A. Brand, 1976; A. Trounson, 1978). Однако, в качестве дополнительной предосторожности от возможности внесения влагалищной инфекции в матку реципиента кембриджские сотрудники покрывали наконечник пистолета пластиковым чехлом. Другие исследования А. Бранда показали, что даже в случае отрицательной бактериологической пробы инструмента после нехирургической трансплантации эмбрионов может произойти вирусное заражение в ходе ее осуществления (A. Brand, 1978). Оно может быть причиной последующих осложнений, в частности, эндометритов. А у коров-доноров, больных эндометритом, наблюдали частичную или полную дегенерацию эмбрионов на разных стадиях их развития, при значительном числе неоплодотворенных яйцеклеток (А.Д. Бугров и соавт., 1988). Поэтому стало необходимым более детально изучить вопросы бактериальной контаминации половых путей коров и телок при манипуляциях извлечения и пересадки эмбрионов, влияние ее на их приживляемость, с одной стороны, и найти эффективные антимикробные средства, с другой стороны.Целью нашей работы была разработка методов профилактики и санитарного контроля технологических процессов при трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота.Для достижения этой цели нами поставлены на разрешение следующие задачи:1. Изучить бактериальную контаминацию половых путей телок-реципиентов в фолликулярную и лютеальную фазы полового цикла.2. Изучить влияние антибактериальных препаратов на микрофлору половых путей после их санации непосредственно перед извлечением и пересадкой эмбрионов.3. Провести сравнительную оценку антибактериальных препаратов для санации половых путей.4. Испытать антибиотики для санации промывных буферных сред и отмывки эмбрионов.5. Изучить влияние испытанных нами антибактериальных препаратов на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов. 1. Обзор литературы1.1 Состояние и перспективы применения метода трансплантации эмбрионовТрансплантация эмбрионов женским особям сравнима по возможностям с техникой искусственного осеменения, позволяющей полнее использовать генотип выдающихся самцов. Однако широкое внедрение этой перспективной технологии сдерживается несовершенством методов получения большого числа зрелых, полноценных, способных к оплодотворению ооцитов (Y. Koinig., 1980), а также сравнительно высокой трудоемкостью и стоимостью работ (В.В. Мадисон, В.Л. Мадисон, 1988).В странах СНГ работы по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота начаты в 1975 г. Первые телята были получены в начале 1977 г. (М.И. Прокофьев и соавт., 1977) во Всесоюзном НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, а первый теленок от пересадки замороженного эмбриона во Всесоюзном институте животноводства в 1980 г. С 1983 года организованы четыре центра трансплантации эмбрионов: ВИЖ, ВНИИРГЖ, НИИЖ Лесостепи и Полесья. УССР, Украинский НИИ разведения и искусственного, осеменения крупного рогатого скота (Н.З. Жильцов, В.В. Мадисон и соавт., 1986). Мировая практика пересадки эмбрионов успешно развивается. Применение метода трансплантации эмбрионов непрерывно растет. При этом технология технически совершенствуется, а эффективность метода возрастает (Ф.И. Осташко, 1995; Т.И. Шкиль, 1995; Ф.С. Мауссе, 1999; М.Л. Дибиров, 2000).В настоящее время наиболее эффективен нехирургический метод трансплантации эмбрионов. В среднем на современном уровне биотехнологи получают с применением пересадки эмбрионов около 10 телят, а в отдельных случаях до 50 телят от одного донора в год, тогда как при обычном способе размножения (искусственном осеменении) корова за всю жизнь могла бы воспроизвести 7-8 телят. Поэтому идея получения максимального числа потомков от лучших по продуктивности самок издавна привлекала внимание исследователей. Решение этой проблемы стало возможным на основе применения метода трансплантации эмбрионов (Ю.Д. Клинский, 1978, 1980; Н.И. Сергеев, 1979,1984; М.И. Прокофьев, 1983).В последние годы в ряде стран изучают вопрос о возможности переноса заразных болезней путем эмбриональной пересадки реципиентам от коров-доноров. Ряд зарубежных авторов считают, что методом трансплантации эмбрионов можно успешно вести борьбу со многими инфекционными болезнями. По некоторым опубликованным данным отдельные инфекции, например, инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея, блутанг, лейкемия крупного рогатого скота реципиентам с трансплантируемым зародышем от больного донора не передаются (R.A. Bowen et al., 1983; Е. Singh et al., 1983; Z. Pokorny et al., 1983; L. Elizabeth, 1984).По данным французских исследователей, вирус лейкоза крупного рогатого скота и вирус катаральной лихорадки при эмбриотрансплантации не передаются через эмбрионы с интактной зоной пеллюцида, если их до пересадки промыть раствором трипсина (W.C. Наге, 1984).Несмотря на достигнутые успехи в разработке приемов вызывания множественной овуляции у коров и телок-доноров эмбрионов, технике извлечения и пересадке зародышей, выход полноценных эмбрионов и их приживляемость не стабильна.Многие вопросы теории и практики требуют дальнейшего изучения и совершенствования.Проблемными остаются вопросы предупреждения заноса инфекции в матку при извлечении и пересадке эмбрионов. 3.2 Чувствительность матки к инфекциям в разные периоды полового циклаЗдоровый организм млекопитающих имеет целую систему защитных приспособлений, поэтому деятельность микроорганизмов-сапрофитов ограничивается и не является болезнетворной. В норме эта микрофлора отсутствует в глубоких отделах полового тракта самки, сообщающегося с брюшной полостью (В.П. Буркат, Г.Г. Харута та ін. 1995; Н.А. Мартыненко, 1971; Е.В. Козловский, П.А. Емельяненко, 1982), хотя во влагалище, помимо постоянно заселяющих его молочнокислых палочек, находят различные виды кокков и другие бактерии. Многочисленными исследованиями установлено, что в половых путях коров с нормальной и нарушенной воспроизводительной функцией часто присутствуют штаммы условно-патогенной микрофлоры: E.coli, Klebsiella, Serritia, Proteus, Pseudomonas (Е.М. Махиня, 1958; D.S. Sambijal et al., 1986; Д.А. Сайкиа и соавт., 1987), но у большинства животных во время течки и охоты микрофлора погибает и смывы, полученные со слизистой оболочки влагалища коров, свободны от микроорганизмов (А.А. Осетров и соавт., 1966). С другой стороны, условнопатогенная микрофлора часто попадает в половые пути самок со спермой производителей, используемой при искусственном осеменении (С.Л. Семенов, 1955; О.И. Пантюхова, 1961; В.А. Яблонский, 1963; Ф.М. Касумов, 1963; Д.Д. Логвинов, 1968).Многие ученые занимались изучением микробной загрязненности спермы производителей (Качмар О.М.; Авдосьева I.К.; Урус Р.В.), применяемой для искусственного осеменения самок, на их репродуктивную функцию. Большинство из них признают отрицательное действие микробов, попадающих в половые пути коров и телок при искусственном осеменении, на их воспроизводительную деятельность. В.К. Милованов (1964) утверждает, что причиной эмбриональной смертности является неспецифическая микрофлора, попадающая в матку со спермой. Д.Д. Логвинов (1972) считает, что прямой причиной снижения качества и оплодотворяющей способности спермы, частых абортов, массовых задержаний последа, эндометритов, бесплодия, эмбриональной смертности и понижения жизнеспособности новорожденных является обильное микробное загрязнение спермы производителей, применяемой для искусственного осеменения самок. Д. Логвинов, В. Плугатырев, В. Кошевой (1972) в 47,9% случаев выделили различные бактерии из околоплодных вод искусственно осемененных коров и в 6% случаев выделили различные бактерии из околоплодных вод естественно осемененных нетелей.Бактериологический метод выделения кампилобактерий из спермы производителей трудоемок, длителен и неэффективен из-за частой контаминации спермы посторонней микрофлорой. Отсутствие антител в сперме животных не всегда позволяет сделать заключение о том, что сперма свободна от возбудителей кампилобактериоза (Родина В.Н., Бондаренко В.З.; Козло В.Н.; Скляров О.Д.; Советкин С.В.).Другие авторы отмечают отсутствие отрицательного влияния естественной контаминации половых путей условно патогенной микрофлорой на воспроизводительную функцию коров и связывают это с тем, что:1. Число микробных тел этих бактерий, попадающих вместе со спермой в матку невелико, оно колеблется от 0 до 10 млн./мл (Б.Д. Кондратов и соавт., 1976).2. В процессе эволюции у животных сложились мощные иммунные барьеры, препятствующие инфицированию половых путей микрофлорой.Основными факторами, обеспечивающими защиту половых путей коров и телок от условно патогенной микрофлоры, являются: а) Барьерные функции слизистых оболочек. Так, слизистая оболочка шейки матки функционирует как железа, выделяющая цервикальную слизь, содержащую муцины, обладающие биологически важными свойствами: абсорбции, бактерицидности, бактериостатичности (Н.А. Мартыненко, 1971; А.И. Варганов, 1979; В.П. Полищук, 1984; В.С. Шипилов, 1988). Р. Рафаван и соавт. установили, что во время течки отмечается сдвиг РН в кислую сторону, что в значительной степени предотвращает проникновение в полость матки через раскрытую шейку матки различных микробов (R. Raghavan et al., 1971, І.Г. Мороз та ін., 2000). Количество шеечного секрета у небеременных коров незначительное, но во время беременности обнаруживается большое скопление его в устье шейки матки в виде слизистой пробки, во время охоты слизь маловязкая, прозрачная и выделяется в большом количестве (В.С. Шипилов и соавт., 1987; 1988).б) Активная деятельность поли- и мононуклеарных фагоцитов (И.И. Соколовская, 1973; С.Д. Ватсон, 1985).в) Наличие системы естественных опсонинов и иммуноглобулинов (И.И. Соколовская, 1973; О.Д. Ватсон, 1985).В период течки под воздействием эстрогенов происходит активация как специфических, так и неспецифических факторов резистентности (В. Вэйнштейн, 1984; С. Ватсон, 1987; С.С. Волков, 1999). При угнетении иммунной реактивности самок микрофлора способна вызвать нарушение пренатального развития зародышей (Н.Н. Михайлов, 1972).Кроме того, при естественном осеменении коров спермии попадают в каудальный отдел шейки матки (А.Г. Нежданов, П.М. Торгун, 1993). Небольшая их часть (около 0,5%), преодолевая барьер из слизистого секрета, проникает в краниальный отдел цервикального канала, откуда быстро транспортируется к верхушкам рогов матки за счет антиперистальтической моторики полового тракта. Описанный механизм способствует продвижению спермиев по половым путям, одновременно препятствуя проникновению микробов (Ф.И. Осташко и соавт., 1972, 1977). При искусственном осеменении сперма впрыскивается в краниальную часть шейки матки или непосредственно в матку, минуя биологический барьер из цервикального секрета. Если при этом сперма содержит микробы, то создаются условия для быстрого обсеменения ими эндометрия, а, возможно, и полости яйцевода. По мере увеличения степени микробной контаминации спермы процент плодотворных осеменений уменьшается (В.К. Милованов, 1940, E.L. Willet, 1951; П.А. Волосков, 1965; Ф.И. Осташко, 1977).Если в период течки, матка коровы устойчива к микробному фактору, то в лютеальную фазу полового цикла матка коровы чувствительна к нему. Это доказали Л. Роусон с сотрудниками (L.E. Rowson et al., 1953). Они одну группу коров осеменяли в лютеальную фазу цикла, другую - в эстральную, затем проводили бактериальную проверку спермы и смывов с шейки матки. Из 11 коров, осемененных в лютеальную фазу цикла, у 8 был пиометрит, у одной - стерильный метрит, у одной, осемененной в первый день после охоты, метрита не было, и еще у одной, осемененной на третий день после охоты, была пиометра. В сперме были обнаружены стафилококки в небольшом количестве. У других 6 коров, осемененных во время охоты, метриты не наблюдались, несмотря на то, что используемая сперма содержала C. Pyogenes.А.В. Квасницкий (1988) в своей книге цитирует результаты эксперимента У. Такнасни, где было показано, что введение осеменительного инструмента в матку эстральной коровы не влияет на ее плодовитость, но аналогичная манипуляция в лютеальной фазе цикла снижает стельность реципиента до 33%, а при введении инструмента в защитном футляре в момент прохождения влагалища, результативность увеличивается до 59% (Y. Taknasni, 1981).М. Кришна и соавторы провели исследования 106 коров, у которых брали пробы слизи из шейки матки в период половой охоты, от 86 были выделены различные бактерии. Другие авторы отмечают, что даже искусственно введенная в половые пути самок сельскохозяйственных животных условно патогенная микрофлора лизируется в течение нескольких суток (M. Krishna et al., 1974, цитата по книге Н. Михайлова, 1976).С.А. Фолькель и соавт. внутриматочно вводили Вг.abortus. Смывы из матки и полученные эмбрионы при исследовании оказались свободными от вводимого штамма Вг. abortus. У одного животного, не проявившего охоту после суперовуляции в смыве из матки, обнаружили вводимый штамм Вг. Abortus (Voelkel S.A., et al., 1983).У 16 искусственно зараженных бруцеллезом коров в университете штата Луизиана Вг. abortus отсутствовала в промывной жидкости и гомогенизированных эмбрионах (R. Bowen et al., 1983; Е. Singh et al., 1983). Таким образом, было подтверждено, что здоровая небеременная матка циклирующих коров подавляет размножение микроорганизмов.П. Шпалюнг сообщает, что присутствие Вг. abortus в небеременных матках носит переходной характер и связано с бактеремической фазой. Она ограничивается или отсутствует из-за воздействия эструса (P. Sparling, 1986).Пейн И.М. и соавт. получили Вг. abortus шт. 544 в небольших количествах из шейки матки 6/6 зараженных небеременных телок в течение 4 мес. после заражения. Это противоречит тезису о том, что микроорганизмы быстро выходят из небеременной матки животных с нормальным эстральным циклом (I. Payne et al., 1960).Однако, в определенных условиях резистентность организма значительно ослабевает и нормальный количественный и качественный состав микрофлоры изменяется, а деятельность ее активизируется. Нарушение целостности защитных покровов кожи и слизистых оболочек также приводит к активизации деятельности сапрофитов, которые проникнув в глубь организма, вызывают развитие в нем болезнетворного процесса (Н.А. Мартыненко, 1971; Г.В. Зверева и соавт., 1987).С другой стороны, у некоторых видов животных существует определенная зависимость чувствительности к маточным инфекциям от уровня стероидных гормонов крови. В частности, доказано, что матка коровы и кролика легко инфицируется в лютеальной фазе цикла и устойчива к заражению в эстральный период (Е. Виллет и соавт., 1951; В. Блэк и соавт., 1953; Л. Роусон и соавт., 1953; А.В. Квасницкий и соавт., 1988; Л.К. Эрнст и соавт., 1989). Своими опытами Блэк, Саймен и соавт. (1953) цит. по кн. Н.А. Мартыненко, 1971; James W. (1971), подтвердили наличие в эстральной матке высокоэффективного защитного механизма против инфекции. Они установили, что прогестерон способствует развитию инфекции, а эстрогены повышают резистентность матки к инфекциям.Исследования Хока с сотрудниками (H. Hawk et al., 1959) показали, что в защитном механизме матки против инфекции тормозящее действие прогестерона играет большую роль, нежели стимулирующее действие эстрогенов.Результаты обследования 19 коров-доноров Львовского центра трансплантации эмбрионов показали, что у всех коров-доноров на 7-ой день после оплодотворения в матке присутствуют живые микроорганизмы, которые заносятся в полость матки во время осеменения. В матке присутствуют ассоциации микроорганизмов 3-6 видов: протей, кишечная палочка, стрептококки, стафилококки, диплококки, синегнойная палочка.Процесс вымывания эмбрионов, как всякое механическое раздражение, способствует размножению микроорганизмов и при этом создаются условия для развития в половых органах инфекционного воспалительного процесса. После проведения нескольких вымываний эмбрионов у коров-доноров развивается эндометрит (В.И. Завирюха, С.П. Хомин, С.Г. Шаловило, А.А. Гамота, 1987). Известно, что матка коровы в лютеальную фазу полового цикла очень чувствительна к инфекции и внешним раздражителям. При неосторожном введении инструментов во время пересадки возникают травмы, сопровождающиеся воспалительными процессами слизистой оболочки шейки матки и эндометрия (Л.К. Эрнст, Н.И. Сергеев, 1989).Литературные данные свидетельствуют о том, что матка коровы чувствительна к микробному фактору в лютеальную фазу и устойчива к нему в эстральную фазу. Извлечение и пересадка эмбрионов осуществляются в лютеальную фазу, поэтому на всех этапах трансплантации эмбрионов необходимо соблюдение правил асептики и осуществление профилактических мероприятий. 3.3 Предупреждение заноса инфекции в матку при извлечении и пересадке эмбрионовВ настоящее время во многих странах ведутся интенсивные работы по разработке оптимальных способов получения и пересадке эмбрионов крупного рогатого скота. Основной задачей этих исследований является повышение приживляемости эмбрионов, которая зависит от многих факторов. Одним из главных условий успешного применения метода трансплантации в животноводстве является асептичность всех проводимых операций. Необходимо точно соблюдать санитарные правила при манипулировании с эмбрионами вне организма, чтобы не допустить их инфицирования и переноса инфекции реципиентам при эмбриотрансплантации (H. Kupferschmid, 1984; E. Singh et al.,1985; А. Овчинников, 1985; Ф. Осташко, 1986; М. Тибье, 1986).Известно, что матка коровы легко инфицируется в лютеальной фазе полового цикла и устойчива к заражению в эстральный период (Л. Роусон, 1953; А.В. Квасницкий, 1988; Л.К. Эрнст, Н.И. Сергеев, 1989).Поскольку нехирургическая пересадка эмбрионов у крупного рогатого скота осуществляется в период диэструса, когда резистентность матки резко понижена к микробному фактору, то даже при отрицательной бактериологической оценке инструментов вирусный контакт не исключается.Субклиническая инфекция у реципиентов после нехирургической пересадки приводит к частым абортам (А.В. Овчинников, 1985).Манипуляция вымывания эмбрионов и подготовка их к пересадке, как было сказано выше, требует тщательных асептических условий. Но даже. при соблюдении их, возможность попадания различной микрофлоры в матку не исключена (Ф.И. Осташко и соавт., 1986; А. Гордон, 1988; А.И. Сергиенко и соавт., 1988).Одной из причин низкой результативности нехирургических пересадок, очевидно, является чувствительность матки к инфекции в лютеальную фазу (Н.И. Сергеев, В.И. Горбунов, 1979).Для предотвращения возможного заноса микрофлоры в полость матки применялись различные устройства. И. Перрин и соавт. использовали приспособление, позволяющее в условиях ферм производить цервикальную трансплантацию не соприкасаясь со средой слизистой влагалища. При этом приживляемость эмбрионов повысилась на 21% (I. Perrin et al., 1982). А. Овчинников (1985) для зачехления инструмента при пересадке эмбрионов использовал специальную защитную оболочку из парафинированной стерильной бумаги.В качестве дополнительной предосторожности от возможной влагалищной инфекции у реципиента сотрудники Кембриджского института покрывали наконечник пистолета Кассу пластиковым чехлом (A. Brand et al., 1978).Большинство практиков в странах СНГ катетер для пересадки эмбрионов покрывают защитной полиэтиленовой оболочкой, которая предназначена для предупреждения контаминации прибора микрофлорой при введении его во влагалище до наружного отверстия шейки матки (В.С. Шипилов и соавт., 1988).Ф.И. Осташко и соавт. (1986) для асептического получения эмбрионов сельскохозяйственных животных, их поиска, оценки и хранения создали специальное устройство.Сыворотка и другие компоненты среды, используемые для сбора, отмывания и культивирования эмбрионов могут быть специальными источниками инфекции, поэтому качество их приготовления должно систематически контролироваться. Кроме того, после извлечения эмбрионов из матки инфицированных и неинфицированных коров-доноров в промывных средах многие исследователи обнаружили бактерии и вирусы (L. Archbald et al., 1981; A. Bouillant et al., 1981;F. Thovas et al., 1975; E. Singh et al., 1983; А.Д. Бугров, И.М. Величко, 1986; А.И. Сергиенко, 1987), что послужило основанием для санирования промывных буферных сред антимикробными препаратами (А.Д. Бугров и И.М. Величко, 1986). В.И. Завирюха, С.П. Хомин, А.А. Гамота, С.Г. Шаловило(1987) отметили, что после проведения нескольких вымываний у коров-доноров развивается гнойный эндометрит.Другим важным моментом при трансплантации является подготовка эмбрионов к пересадке.Ряд зарубежных авторов считают, что уязвимость эмбриона патогенами маловероятна из-за основной резистентности, которая обеспечивается зоной пеллюцида, и факторов вторичной резистентности таких, как ранний возраст, малые размеры и ограниченная подвижность, что уменьшает потенциальную возможность воздействия патогенов на эмбрион. То, что многие бактериальные и вирусные патогены, как было доказано, слишком велики, чтобы проникнуть сквозь прозрачную оболочку и что некоторые не выживают в питательной среде эмбриона, объясняет дальнейшее уменьшение возможности передачи инфицирующего агента во время пересадки эмбриона.Зона пеллюцида (толщина 5-15 мкм) является эффективным барьером для микроорганизмов. Исследования показали, что это касается большинства микробов, вызывающих заболевания у крупного рогатого скота. При тщательном промывании эмбриона, с интактной прозрачной оболочкой, исчезали все признаки патогенных агентов (E. Singh et al., 1982; R.A. Bowen et al., 1983; D. Stringfellow et al., 1984; Z. Mallek et al., 1984; W. Hare et al., 1985).Микробиологические исследования in vitro показали, что отмывка эмбрионов в нескольких стерильных средах снижает концентрацию вирусов и бактерий в среде до неопасного субинфекционного уровня уже после третьего разбавления. Технически отмывка эмбрионов выполняется путем последовательного переноса микропипеткой эмбриона с минимальным количеством жидкости (около 0.01 мл) из одной стерильной чашки с 1 мл среды в другую. Разбавление концентрации исходного раствора среды при этом таково, что уже в третьей чашке она превышает в 1000 раз, а в девятой чашке даже тонкий анализ не выявляет следов инфекции. Дополнительную гарантию полного блокирования случайной инфекции дает добавление антибиотика в стерильную среду. Эффективность такого способа подтверждена в опытах с использованием вирусов блутанга, акабаны, инфекционной диареи (E. Singh et al., 1982), бруцеллы абортус (D. String fellow et al., 1984).В настоящее время известно, что только вирусы инфекционного ринотрахеита (E. Singh et al., 1982) и везикулярного стоматита (L. Laurman et al., 1985) взаимодействуют с оболочкой эмбриона и остаются на ней даже после многократных отмываний. Результаты исследований А.И. Сергиенко и соавт. (1988) показывают, что даже десятикратная промывка не обеспечивает освобождение эмбрионов от вируса ИРТ. Только обработка эмбрионов ферментами (трипсином) или антисывороткой эффективно удаляет вирусы с оболочки (E. Singh et al., 1983). В результате обработки эмбрионов ферментом растворяется верхний слой оболочки и полностью удаляются (инактивируются) налипшие на ней вирусные частицы.С другой стороны, культивирование зародышей in vitro осуществляли при высокой концентрации микроорганизмов и вирусов в среде, которая в естественных условиях in vivo менее вероятна. После использования трипсина вирусы ринотрахеита и везикулярного стоматита на оболочке не обнаруживали. Повреждение оболочки или ее отсутствие приводило к инфицированию зародыша и его гибели при блутанге, ящуре, ринотрахеите.Освободившаяся от прозрачной оболочки бластоциста представляет собой полый внутри шар, наружная стенка которого состоит из одного слоя питающих клеток (трофобласт), а внутри на одном из полюсов бластоцисты, располагается скопление собственно зародышевых клеток (эмбриобласт). В просвете матки бластоциста остается свободной и перемещается до 13-14 дня (K.M. Shelesnyak, 1960; C. Lutwak - Mann, 1959). В конце этого периода бластоциста прикрепляется трофобластом. к слизистой оболочки стенки матки имплантируется. В этот период отмечена высокая повреждаемость и смертность зародышей. Разного рода неблагоприятные факторы извне могут, не повреждая самого зародыша, нарушить ход становления его связи с материнским организмом. К числу таких факторов относится патогенная и условно патогенная микрофлора.А.И. Сергиенко и соавт. (1988) обнаружили в среде Дюльбекко после вымывания эмбрионов 6 видов бактерий: St.albus, St.citreus, B.subtilis, E.coli, Pr.vulgaris, грибы.Анализируя литературные данные Н.А. Мартыненко (1971) пишет, что обычно эмбриональная смертность на почве инфекции завершается изгнанием плода. В абортированном материале чаще всего обнаруживаются стрептококки и стафилококки. Проникнув в матку, они находят там подходящую для себя среду и быстро размножаются, вызывая некроз котиледонов и нарушая таким образом связь плода с маткой, кроме того они проникают в ткани плода и отравляют его своими токсинами или вызывают внутриутробную инфекцию (Д.Д. Логвинов, В.П. Плугатырев, Г.Г. Хатура, А.Г. Миллер, 1988).Установлено, что матка коровы наиболее чувствительна к инфекциям в лютеальную фазу полового цикла, вначале которой трансплантируются эмбрионы. Большинство авторов отмечают, что при нехирургической трансплантации катетер проходя через влагалище в шейку матки, неизбежно захватывает огромное количество микробов. Проблема микробной деконтаминации решается за счет антибиотиков или же надежной асептики. Последнее обеспечивается помещением трансплантационного инструмента в защитный чехол для проведения его через влагалище.В литературе имеется достаточное количество сведений о наличии микрофлоры в матке коровы в разные периоды полового цикла и влияние ее в период беременности на материнский организм и зародыш. Однако, остается неясным вопрос о микробной контаминации отдельных участков половых путей на 7-8 день полового цикла, т.е. оптимального времени трансплантации эмбрионов. А также не разработаны методы профилактики и санитарного контроля на всех этапах извлечения и пересадки эмбрионов.3.4 Влияние микроорганизмов на спермии, яйцеклетки и эмбрионыМногочисленные исследования были проведены учеными по определению влияния микроорганизмов на различные биологические объекты такие, как спермии, яйцеклетки и эмбрионы.Несмотря на противоречивость данных о влиянии микроорганизмов на переживаемость спермиев (Беликов А.А.), большинство исследователей придерживаются мнения, что микрофлора губительно действует на них, снижая переживаемость спермиев, их оплодотворяющую способность и даже на развитие плода (С.Л. Семенов, 1955; И. Пантюхова, 1962, В.А. Яблонский, 1963; Г.В. Зверева, 1963, 1968, 1974; Н.Г. Балашов, 1965; J. Krolinski, 1977). Часто из спермы быков выделяли большое количество микробов. Д. Голубева (1965) выделила 16 видов микроорганизмов, М. Касумов (1963) - 16 видов, Е.П. Кремнев, А. Банакова(1974) - 23 вида, Т.Е. Яковлев(1968) -27 видов, Д.Е. Дорожилов и соавт. (1974) - 32 вида микробов и 13 видов плесени. При идентификации микроорганизмов, выделенных из спермы быков, установили их видовую принадлежность. Это были чаще всего E.coli, Ps. aeruginosa, Bac. subtilis, Proteus vulgaris и различные кокковые формы (А. Железнов, 1966; Н.Г. Балашов, 1989).Об отсутствии отрицательных действий бактерий, в том числе и синегнойной палочки, на жизнеспособность спермиев сообщено в публикациях авторов (Edmonson et al., 1949; E. Hakkesteedt, 1949; W.P. Scheser, 1951; Baier et al., 1971).Одни исследователи утверждают, что микробы, находящиеся в сперме, располагаются около спермиев или оседают на них в один или 2-3 ряда. В местах оседания микробов оболочка спермиев как бы вдавливается, прогибается, а при длительном контакте ферменты бактерий вызывают распад спермия, а затем его гибель (Г.В. Зверева, 1963). В литературе есть данные по отрицательному влиянию микробов на яйцеклетки. П.А. Волосков и соавт. (1971) сообщили, что микробы, абсорбированные спермиями, могут проникнуть и в яйцеклетку. Дальнейшая судьба инфицированного эмбриона зависит от вида и количества микробов и бактерицидных свойств жидкости бластоцисты.Другие исследователи отрицают негативное влияние микробов на яйцеклетки. В 184 опытах Б.П. Токина, А.Г. Филатова (1953), в которых яйцеклетки кролика помещались в зараженную среду, показали высокую бактерицидность. Они утверждают, что бактерицидные свойства яйцеклетки сохраняются ею и после оплодотворения (Б.П. Токин и соавт., 1956). Однако, следует отметить, что в вышеописанных опытах Б.П. Токина и А.Г. Филатова в качестве среды служила капля физиологического раствора, зараженного одним из следующих видов микробов: Microkoccus lysodeicticus, Bact. megatherium, Bact. speciens и соавт. Во всех случаях вокруг яйцеклетки наблюдалось значительное угнетение роста и размножения бактерий (Цитата по книге Н.А. Мартыненко, 1971).Однако следует отметить, что в опытах Б.П. Токина и А.Г. Филатова с яйцеклетками и бластоцистами самой устойчивой оказалась культура золотистого стафилококка. Действие специфической половой инфекции ими не испытывалось.Насколько можно судить по результатам эксперимента Р. Гваткина (R. Gwatkin, 1967) перед вирусной инфекцией яйцеклетка беззащитна. Проникновение вирусов обычно происходит через и каналы прозрачной оболочки. Вирус Mengoencephalitis обнаруживали в перевителиновом пространстве мышиной морулы уже через 10 минут после помещения ее в среду, содержащую вирусы. Поражалось от 93 до 100% морул.С начала 80-х годов стали поступать новые научные данные о надежной барьерной функции неповрежденной зоны пеллюцида, окружающей эмбрион до 8-9 дня развития. До выхода из оболочки эмбрион не может быть инфицирован микробным или вирусным агентом, даже если донор был искусственно заражен возбудителем бруцеллеза, лейкоза, вирусной диареи, инфекционного ринотрахеита, везикулярного стоматита, ящура, блутанга и акабаны (W. Hare, 1986; С. Z1 Ecuger, 1986; H. Niemann, 1986; Е. Singh, 1987; M. Thibier, 1987).Известно, что у крупного рогатого скота эмбрионы первые 13 дней свободно перемещается в просвете матки, а на 9-10 день она теряет зону пеллюцида. Влияние в это время какого-нибудь неблагоприятного фактора, например, микроорганизмов или вирусов, может привести к гибели зародыша (A.M. Scofield et al., 1974; Н.П. Чечеткина, П.П. Фукс и соавт., 1987). Эти авторы подвергали бактериологическому исследованию матки 39 свиней, убитых через 9 или 13 дней после случки. При этом у 22 свиноматок матка не была инфицирована, у 12 - инфицирована и у 4 - частично инфицирована. Авторы установили статистически значимое различие в количестве погибших яйцеклеток или эмбрионов в инфицированных и неинфицированных матках, и считают, что основной причиной гибели эмбрионов в ранний период супоросности является микробная загрязненность матки.И. Сакала и соавт., И. Линн и соавт. установили, что введение в половые пути коров микробов, принадлежащих к группе коменсалов, населяющих обычно кишечник или кожный покров, приводит к нарушению полового цикла, патологическим явлениям и резкому снижению оплодотворения животных (I. Sakala et al., 1961; I.E. Lynn et al., 1966).Несмотря на противоречивость литературных данных, большинство авторов склонны к тому, что микроорганизмы отрицательно влияют не только на переживаемость и оплодотворяющую способность спермиев, оплодотворение яйцеклетки, но и на выживаемость эмбрионов.Если для искусственного осеменения крупного рогатого скота приняты санитарные нормы для неразбавленной спермы быков, которыми допускается содержание не более 5 тыс. непатогенных микробов в 1 куб. см (Н.Г. Балашов, 1989), то при трансплантации эмбрионов этот фактор не учитывается, хотя предусмотрен санитарный контроль их качества.В связи с этим перед нами возникла необходимость проведения исследований по влиянию количества и качества микроорганизмов на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов у крупного рогатого скота.3.5 Влияние антибиотиков на спермии, яйцеклетки, эмбрионыМногие исследователи установили, что одной из причин снижения биологического качества спермы, возникновения гинекологических заболеваний, абортов и бесплодия самок может быть контамированная сперма (Г.В. Зверева, 1971; В.С. Шипилов, 1977; Н.Г. Балашов, 1980; Ф.И. Осташко, 1977; С.И. Сердюк, 1979). Поэтому учеными были проведены многочисленные исследования по санированию спермы. В качестве санирующих средств испытали такие антимикробные препараты, как антибиотики и сульфаниламиды. Механизм действия большинства антимикробных средств был известен, при этом необходимо было подобрать вещества с избирательным действием на микроорганизмы так, чтобы они не оказывали токсичного действия на биологические объекты: спермии, I яйцеклетки, эмбрионы и т.д. (Н.Г. Балашов, 1980,1981).Многие исследователи доказали эффективность большинства антибиотиков и сульфаниламидов при использовании их для санации спермы (R.H. Foote et al., 1948; N. Yoshida et al., 1951; И.И. Соколовская и соавт., 1956). А также установили, что не все антибиотики можно использовать для деконтаминации спермы из-за их токсичности, устойчивости разных видов микробов к ним (И.И. Соколовская, 1960; А.П. Волосевич, 1963; С.И. Сердюк и соавт., 1970).Примером является токсичность многих серий стрептомицина и резистентность микроорганизмов к пенициллину и стрептомицину. Поэтому дальнейшие исследования были направлены на поиск комплексов антибиотиков широкого спектра действия и нетоксичных для спермиев (Косарев С.Р.).С.Р. Косарев с сотрудниками (1984) испытали 15 антимикробных препаратов на их безвредность и влияние на микроорганизмы. Ими установлено, что лучшими из них являются комплекс пенициллин + канамицин по 250 тыс. Ед и гентамицина 150 тыс. Ед на 100 мл среды для разбавления спермы.Т. Стоянов (1987) в своих опытах показал, что гентамицин, амоксициллин, канамицин и полимиксин сохраняют переживаемость сперматозоидов на том же уровне, что и контрольная среда без антибиотиков не убивает микробы, а лишь задерживает их рост и размножение, в дальнейшем они подавляются защитными силами макроорганизма (Д.К. Червяков, А.Н. Терезова, 1980).П.А. Чахмахчев (1989) изучил эффективность применения полимиксина- М сульфата, спермосана-3 и спермосана-ППК в средах при разбавлении спермы быков и установил, что лучшим препаратом является спермосан-ППК.В последние годы в ветеринарной практике широко используется антибиотик гентамицин, который обладает широким антимикробным спектром. Он действует бактерицидно, подавляя синтез белка, ингибируя процессы трансляции и активен по отношению к стафилококкам, эшерихиям и псевдомонадам (А.С. Новохатский и соавт., 1975; Д.Ф. Осидзе, 1981; С.М. Кузнецова, 1983; В.Ф. Ковалев и соавт., 1988).Несмотря на неодобрение многих авторитетов, применение комплекса антибиотиков стало обычным делом в клинической практике. Наиболее хорошо известным примером синергизма между антибиотиками является взаимодействие пенициллинов саминогликозидами. Этот комплекс проявляет синергизм в отношении зеленящих стрептококков, энтерококков, золотистых стафилококков, листерий и грамотрицательных палочек (С.М. Кузнецова, 1983).Механизм синергизма между пенициллинами и аминогликозидами не известен. Он может состоять в увеличении проникновения аминогликозидов в бактериальную клетку в присутствии пенициллина, который ингибирует синтез клеточной стенки, как это было предложено при объяснении действия комбинации пенициллин + аминогликозиды на энтерококки. Однако, независимо от возможного механизма имеющиеся данные показывают, что комбинированное лечение может значительно повысить эффективность антибиотикотерапии инфекций, вызванных Ps. aeruginosa (И.С. Чекман и соавт., 1986; В.Ф. Ковалев и соавт., 1988).Санирующий эффект препарата зависит от дозы: чем больше доза препарата, тем отчетливее выявляется санирующий эффект. Однако увеличение дозы приводит не только к усилению действия препарата, но и к повышению его токсичности (Н.Г. Балашов, 1980).А.С. Новохатский, С.С. Герасимова (1975) изучали цитотоксические свойства гентамицина. Они установили, что гентамицин в концентрации 10, 20 и даже 30 мкг/мл не вызывал нарушений целостности клеточного пласта после 24 часовой инкубации при температуре 37°С. Концентрация 50 мкг/мл и больше приводила к цитотоксическому изменению клеток. А.П. Простяков и С.П. Сергеева (1980) отметили высокую стабильность гентамицина в культуральной среде (6 дней период полураспада), а также цитотоксическую (3000 мкг/мл) и рекомендуемую концентрацию (200 мкг/мл).В опытах Х.Г. Михаеляна (1988) в культуральной среде с концентрацией гентамицина 50 мкг/мл созревание ооцитов достигло 100%, из них 84% клеток созрело до стадии метофазы II, в контроле (без антибиотиков) до этой же стадии созревало только 70%.Для подавления же большинства микроорганизмов достаточна концентрация гентамицина 4 мкг/мл (Д.Ф. Осидзе, В.Ф. Ковалев, К.С. Масловский, 1981).В 1986 г. для санации вымывных буферных сред в лаборатории трансплантации А.Д. Бугровым, И.М. Величко и соавт. предложен и испытан комплекс антибиотиков гентамицин + пенициллин (ампициллин) в концентрациях 12 мкг/мл и 100 Ед/мл, соответственно. Эта комбинация дала хороший антимикробный эффект по отношению к микроорганизмам, встречающимся в половых путях доноров (E.coli, Staph. aureus, Bac.subtilis, Pseudomonas aeruginosa). По данным И.С. Чекмана (1986) гентамицин не совместим с антибиотиками из группы бензилпенициллин, совместим с изотоническим раствором хлористого натрия. При совместном применении гентамицина с ампициллинонатриевой солью, карбенициллином или линкомицином усиливается их антибактериальный эффект.Т.А. Зацепилова и А.Н. Кудрин (1983) установили, что переход лекарственных веществ из жидкости матки через оболочку морулы и бластоцисты зависит от его молекулярной массы.Многие авторы независимо друг от друга определяли влияние антибиотиков на яйцеклетку. Так, М.Ф. Карашаев (1987) установил отрицательное влияние комплекса антибиотиков пенициллин + стрептомицин (100 Ед/мл и 50 мкг/мл) на созревание ооцитов.Таким образом, можно сделать вывод, что применением антибиотиков, как компонентов сред, можно контролировать развитие микрофлоры. Однако не все антибиотики, которые обладают широким спектром антимикробного действия, можно использовать для санации спермы, промывных буферных сред, эмбрионов. Лучшими комплексами антибиотиков для них являются аминогликозиды в сочетании с пенициллинами, примером которых, является гентамицин. Из пенициллинов в комбинации с гентамицином лучше всего сочетается ампициллин.Анализ литературных данных показал, что несмотря на достигнутые успехи в эмбриотрансплантации, проблемными остаются вопросы по приживляемости эмбрионов. Известно много причин, влияющих на приживляемость эмбрионов, одной из которых является микробный фактор. Хотя многие известные ученые не учитывают влияние микрофлоры на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов считая, что эмбрионы с интактной зоной пеллюцида надежно защищены от микробов и вирусов. Однако в литературе есть данные о том, что некоторые вирусы и прилипают к прозрачной оболочке и заносятся вместе с эмбрионом в матку реципиента, оказывая негативное влияние на него. Недостаточное количество противоречивых данных о влиянии микроорганизмов на приживляемость эмбрионов стало основанием для проведения исследований по данной проблеме.С целью предупреждения заноса инфекции при трансплантации отечественными и зарубежными учеными разработаны различные технологии, приемлемые в хорошо оборудованных центрах трансплантации эмбрионов. В производственных условиях необходимы дополнительные меры профилактики микробной загрязненности. Известно, что лучшими антимикробными средствами являются антибиотики. Тем не менее, в доступной для нас литературе мало данных о влиянии антибиотиков на эмбрионы. Поэтому перед нами встала задача изучить влияние различных антибиотиков и их доз для профилактики микробной контаминации на всех этапах эмбриотрансплантации. 2. Собственные исследования2.1 Цель и задачиЦелью нашей работы была разработка методов профилактики и санитарного контроля технологических процессов при трансплантации эмбрионов у крупного рогатого скота.Для достижения этой цели нами поставлены на разрешение следующие задачи:1. Изучить бактериальную контаминацию половых путей телок-реципиентов в фолликулярную и лютеальную фазы полового цикла.2. Изучить влияние антибактериальных препаратов на микрофлору половых путей после их санации непосредственно перед извлечением и пересадкой эмбрионов.3. Провести сравнительную оценку антибактериальных препаратов для санации половых путей.4. Испытать антибиотики для санации промывных буферных сред и отмывки эмбрионов.5. Изучить влияние испытанных нами антибактериальных препаратов на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов.2.2 Материалы и методика исследованийВсе исследования по данной работе проводились в лаборатории трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных Харьковского биотехнологического центра Украинской академии аграрных наук и на пункте трансплантации эмбрионов опытного хозяйства «Кутузовка». Работа выполнялась в период с июля 2000 года по август 2001 года.Пункт трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота, построенный по типовому проекту, имеет манеж для санитарной обработки животных перед операцией, операционную, поисковую и стерильный бокс для первичной обработки эмбрионов, помещение для замораживания и хранения эмбрионов, моечную и др. В манеже и операционной расположены специальные фиксационные станки. Операционная, поисковая и стерильный бокс оборудованы бактерицидными лампами. Пункт оснащен необходимым лабораторным, технологическим оборудованием и лабораторной посудой.Предметом исследования были коровы и телки черно-пестрой породы и полученные от них эмбрионы.В опытном хозяйстве «Кутузовка» беспривязная система содержания на глубокой несменяемой подстилке.Кормление животных проводили по общепринятым нормам. Рационы были сбалансированы по общей питательности, белку, фосфору, кальцию и витаминным добавкам.Животные регулярно подвергались ветеринарно-профилактическим и санитарным обработкам, клинико-гинекологическим обследованиям, постоянно находились под ветеринарно-зоотехническим наблюдением.Исследования проводили на коровах-донорах и телках-реципиентах с нормальным состоянием половых органов и цикличностью воспроизводительной функции. Опытная группа состояла из коров в возрасте 3-8 лет, с живой массой 500-600 кг и телок в возрасте 16-18 месяца, с живой массой 350-380 кг. В контрольную группу отбирали коров и телок методом пар-аналогов. В экспериментах использовано 25 коров-доноров и 60 телок - реципиентов. Для вызывания суперовуляции применяли препараты ФСГ.Животные обрабатывались по 4-х дневной схеме ФСГ_п производства фирм «Schering Corp» или» Burns Biotec» США и ФСГ-супер (Россия) в общей дозе 50 мг (Табл. 1). Таблица 1. Схема гормональной обработки коров-доноров препаратом ФСГ_п (50 мг) производства США|
День эстрального цикла | Название препарата | Доза (мг) | Общая доза | | | | утро | вечер | | | 10-12 | ФСГ_п | 7 | 7 | 14 | | 11-13 | ФСГ_п | 6,5 | 6,5 | 13 | | 12-14 | ФСГ_п | 6 | 6 | 12 | | | Простогландин | 250 | 250 | 500 мкг | | 13-15 | ФСГ_п | 5,5 | 5,5 | 11 | | 14-16 | Охота и осеменение | | | | | 21-23 | Нехирургическое извлечение эмбрионов | | | | | |
Синхронизация полового цикла доноров и реципиентов осуществлялась инъекцией экстрофана.Осеменение коров-доноров проводилось двукратно двойной дозой замороженно-оттаянной спермы с содержанием не менее 25 млн. активных спермиев (рис. 1). Из спермодозы готовили мазки для определения патологических форм спермиев. Мазки высушивали, фиксировали и окрашивали гематоксилином Караччи. Сперму, содержащую 18% и более патологических спермиев, выбраковывали, так как высокий процент патологических спермиев снижает оплодотворяющую способность спермы.Рис. 1. Нормальные спермии быкаРис. 2. Патологические формы спермиевРис. 3. Патологические формы спермиевРис. 4. Патологические формы спермиевДля бактериологических исследований использовали мясо-пептонный агар (МПА) и мясо-пептонный бульон (МПБ), среду Китт-Тароцци, Сабуро и Булира, агар Эндо.МПА и МПБ использовали для культивирования различных микроорганизмов неопределенного состава.Для культивирования анаэробных микроорганизмов использовали среду Китт-Тароцци (МППБ).Среду Булира и агар Эндо применяли для культивирования кишечной палочки.Для выращивания грибов использовали среду Сабуро.Все среды перед бактериологическим исследованием разливали в пробирки по 5 мл. Пробирки закрывали ватно-марлевыми пробками и стерилизовали автоклавированием при температуре 120°С в течение 15-30 минут. МПА после стерилизации скашивали, установив пробирки в наклонном положении до застывания среды.Среду, предназначенную для культивирования бактерий на чашках разливали по 20-25 мл и оставляли на несколько минут до застывания агара. Когда требовалось вырастить микроорганизмы на агарезированной среде в виде изолированных колоний, чашки после засева помещали в термостат дном вверх.Отбор проб для бактериологических исследований проводили на всех этапах подготовки эмбрионов к трансплантации.2.2.1 Подготовка лаборатории, посуды и инструментов для манипулирования с эмбрионамиВ помещениях лаборатории, где подготавливали инструменты, оборудование, посуду, среды для получения, пересадки и криоконсервации эмбрионов, ежедневно проводили влажную уборку.
|
|
 |
НОВОСТИ |
 |
|
| Изменения |
|
| Прошла модернизация движка, изменение дизайна и переезд на новый более качественный сервер |
|
